【正文】 態(tài)[7]。幾十年前，McClintock就曾預(yù)言，漸滲雜交對(duì)植物基因組來說是一種強(qiáng)烈的“沖擊”(genome shock)，在這種情況下，基因組內(nèi)沉默狀態(tài)的轉(zhuǎn)座元件被激活，從而對(duì)這一沖擊發(fā)生反應(yīng)并引起基因組的重建。盡管尚缺少漸滲雜交和轉(zhuǎn)座元件激活之間因果關(guān)系的直接證據(jù)，但一些間接的觀察得出的結(jié)論與McClintock的預(yù)言相一致，而且越來越多的研究也支持這一假說。研究表明，菰DNA漸滲雜交能夠引起水稻基因組中幾種LTR逆轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加以及MITE類轉(zhuǎn)座子mPing和Pong的激活[8]；小麥族遠(yuǎn)緣雜交及多倍化可激活轉(zhuǎn)座子元件、蛋白質(zhì)編碼序列以及一些未知功能的序列[9]；兩種煙草Nicotiana otophora和N. tabacum的種間雜交、兩個(gè)wallaby種間雜交等植物的研究都能夠?yàn)榉N間雜交激活沉默的轉(zhuǎn)座元件提供有力的證據(jù)?？傊瑥囊陨涎芯靠梢钥闯?，遠(yuǎn)緣雜交可激活基因組中沉默的轉(zhuǎn)座元件，這很可能是遠(yuǎn)緣雜交打破了基因組內(nèi)部表觀遺傳抑制控制（如甲基化狀態(tài)的改變）的結(jié)果。 植物逆轉(zhuǎn)座子的研究進(jìn)展 轉(zhuǎn)座元件（Transposable element, TE）是指在植物基因組中從染色體的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)或者從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)染色體上的DNA 序列[10]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座機(jī)制不同，轉(zhuǎn)座元件可分為兩個(gè)主要類型：第一類以RNA為中間媒介通過DNARNADNA 的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，每轉(zhuǎn)座一次其拷貝數(shù)就增加一個(gè)，由于其轉(zhuǎn)座過程經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄過程，因此稱為逆轉(zhuǎn)座子；第二類是以DNADNA 方式增殖的轉(zhuǎn)座元件，它們從基因組的一個(gè)位點(diǎn)切下后插入基因組的另一個(gè)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座前后不涉及拷貝數(shù)的變化，稱為DNA轉(zhuǎn)座子[11]。 逆轉(zhuǎn)座子的類型與結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)座子是真核生物中數(shù)量最多、分布最廣泛的轉(zhuǎn)座元件。根據(jù)長末端重復(fù)序列（long terminal repeat, LTR）的有無，逆轉(zhuǎn)座子可分為LTR 逆轉(zhuǎn)座子和nonLTR 逆轉(zhuǎn)座子兩類。LTR 逆轉(zhuǎn)座子根據(jù)其 POL（Polyprotein）區(qū)編碼蛋白的相似性及排列順序，又可分為 Ty1copia 和Ty3gypsy 兩類。 植物的LTR逆轉(zhuǎn)座子研究的最為廣泛，其結(jié)構(gòu)與逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA結(jié)構(gòu)基本相似（圖1），只是缺少逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白基因，其LTR長度從100 bp到5 kb不等，LTR不編碼蛋白質(zhì)，包含對(duì)轉(zhuǎn)座起重要作用的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)和終止信號(hào)。LTR逆轉(zhuǎn)座子內(nèi)部主要包括gag和pol基因區(qū)，gag基因區(qū)編碼的蛋白負(fù)責(zé)逆轉(zhuǎn)座子RNA的成熟和包裝，pol編碼四個(gè)與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白，分別為prot（蛋白酶），RT（逆轉(zhuǎn)錄酶），RNaseH和int（整合酶），其中RT和RNaseH是逆轉(zhuǎn)座子復(fù)制和轉(zhuǎn)座必需的，int負(fù)責(zé)逆轉(zhuǎn)座子插入到基因組的新位點(diǎn)。根據(jù)pol基因的同源性以及排列順序，LTR逆轉(zhuǎn)座子又可分為Ty1copia和Ty3gypsy兩類。在Ty1copia類逆轉(zhuǎn)座子中，int基因排列在RT和RNaseH之前，而Ty3gypsy類逆轉(zhuǎn)座子的int基因在RT和RNaseH之后，位于POL基因區(qū)的末端[12]。 圖1 LTR逆轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)LTR：長末端重復(fù)； gag：種群專一性抗原；pro：蛋白酶；RT：逆轉(zhuǎn)錄酶；RnaseH：核糖核酸酶；int：整合酶；PBS：引物結(jié)合位點(diǎn)；PPT：多嘌呤位點(diǎn) The structures LTR retrotransposonsLTR: long terminal repeat。 gag: groupspecific antigen。 prot: protease。 RT: reverse transcriptase。 RNaseH: ribonuclease H。 int: integrase。 PBS: primer binding site。 PPT: polypurine tract. 逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性植物基因組中的逆轉(zhuǎn)座子在正常生長條件下通常沒有轉(zhuǎn)座活性，其原因如下：（1）植物基因組中的大部分逆轉(zhuǎn)座子含有終止密碼子突變、移框突變等現(xiàn)象，不能夠形成轉(zhuǎn)座。（2）植物基因組中存在抑制逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座活性的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。（3）復(fù)雜的轉(zhuǎn)座過程，轉(zhuǎn)座具有轉(zhuǎn)錄、RNA加工、mRNA的輸出、翻譯后修飾、插入核酸、反轉(zhuǎn)錄及整合等許多步驟，其中任何一步都可能限制逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性[13,14]。在一般情況下，逆轉(zhuǎn)座子以靜止?fàn)顟B(tài)存在于植物中，但部分逆轉(zhuǎn)座子仍具有轉(zhuǎn)座潛能，能夠被各種生物和非生物脅迫所激活如包括原生質(zhì)體分離、組織培養(yǎng)、外傷、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）等非生物脅迫能夠大大提高Tnt1和Tto1逆轉(zhuǎn)座子的表達(dá)[15]。同時(shí)許多生物因素，如病毒、細(xì)菌、真菌病原物以及真菌提取物接種，也可以導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄激活[16,17]。另外，漸滲雜交也能夠誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)座活性。 逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制LTR逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制比較復(fù)雜，其轉(zhuǎn)座類似逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù) 制，是逆轉(zhuǎn)錄酶主導(dǎo)的反應(yīng)，以 DNARNADNA方式轉(zhuǎn)座。LTR不編碼蛋白質(zhì)，但含有對(duì)轉(zhuǎn)座起重要作用的啟動(dòng)和終止信號(hào)。LTR 逆轉(zhuǎn)座子以其5’端LTR下游的由十幾個(gè)堿基組成的mRNA 的引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）與宿主細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的tRNA互補(bǔ)合成短的RNA 雙鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶以此tRNA 為引物合成第一條DNA 鏈，與tRNA 形成RNADNA雜合鏈。LTR逆轉(zhuǎn)座子中的RNaseH 專一地消化RNADNA雜合鏈上的RNA，形成單鏈DNA，然后以此單鏈DNA 為模板，位于3’端LTR 上游的多嘌呤序列（PPT）作為引物合成雙鏈線性DNA 鏈。在INT（整合酶）的作用下，染色體上靶位點(diǎn)的DNA雙鏈被切開，同時(shí)對(duì)將插入的雙鏈DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生35bp不等的缺痕，合成完畢、具有逆轉(zhuǎn)座子完整結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA轉(zhuǎn)移到靶位點(diǎn)時(shí)，該位點(diǎn)的DNA 片段兩側(cè)形成35bp 的重復(fù)[18]。 SSAP是由Waugh等根據(jù)AFLP標(biāo)記而改進(jìn)的一種基于逆轉(zhuǎn)座子LTR序列的錨定的AFLP技術(shù)，用于檢測(cè)逆轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)與鄰近限制性酶切位點(diǎn)之間的 DNA 多態(tài)性（圖2）。在眾多逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記中，SSAP被認(rèn)為是多態(tài)性最豐富、靈敏度最高、反映的多態(tài)性信息量最多的一種類型。其原理與操作流程與AFLP 相類似，首先用限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生具有粘性末端的限制性片段，然后將這些片段與其末端互補(bǔ)的已知序列的接頭相連接，所形成的帶接頭的特異序列作為隨后預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的模板。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后作為選擇性擴(kuò)增的模板，引物分別為接頭特異引物和基于逆轉(zhuǎn)座子中保守序列（如LTR）而設(shè)計(jì)的引物。SSAP擴(kuò)增的多態(tài)性來源主要有以下三個(gè)：第一是限制性位點(diǎn)及其兩側(cè)序列的變異；第二是LTR 5’末端的變異；第三是逆轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的變異。其中第一種變異與AFLP所檢測(cè)的變異一樣，而后兩種變異則是由逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的。因此，理論上SSAP多態(tài)性高于AFLP，目前許多有關(guān)SSAP 和AFLP 相比較的報(bào)道也表明前者多態(tài)性高于后者[19,20,21,22]。 圖2 逆轉(zhuǎn)座子序列特異擴(kuò)增多態(tài)性（SSAP）擴(kuò)增原理Figure 2 Amplification strategy of SSAP (Sequencespecific amplification polymorphism) marker SSAP分子標(biāo)記的應(yīng)用由于SSAP分子標(biāo)記多態(tài)性高, 操作簡單而且費(fèi)用低等特點(diǎn), 利用這種標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性及種內(nèi)、種間的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)于親本選配和品種純度鑒定具有十分重要的意義。利用BARE1的反向重復(fù)序列區(qū)設(shè)計(jì)的SSAP引物被應(yīng)用于小麥四倍體、大麥品種之間的遺傳多態(tài)性分析以及親緣關(guān)系系統(tǒng)樹的構(gòu)建,且通過SSAP標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了一些常規(guī)圖譜發(fā)現(xiàn)不了的品種間的隱秘變異[23]。Venturi等運(yùn)用SSAP分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蘋果新品種的芽變可能是由于逆轉(zhuǎn)座子插入新位點(diǎn)產(chǎn)生。除此之外, SSAP技術(shù)還被用于大麥、萵苣等植物QTLs定位以及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。漸滲雜交是植物界普遍發(fā)生的現(xiàn)象，并成為促進(jìn)植物遺傳變異的重要手段[24]。作為栽培稻的祖先，野生稻是一個(gè)天然的基因庫，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、強(qiáng)耐冷、抗旱、抗多種病蟲害等優(yōu)良特性，前人的研究表明野生稻比栽培稻具有更高的遺傳多樣性，因此，將野生優(yōu)異基因轉(zhuǎn)入到栽培種中，是擴(kuò)大水稻遺傳基礎(chǔ)和實(shí)現(xiàn)水稻遺傳改良的重要途徑，已經(jīng)成為國內(nèi)外育種家孜孜不倦的追求目標(biāo)。眾多育種工作者構(gòu)建了一些高代重組自交系，并對(duì)一些重要農(nóng)藝性狀的遺傳及生理學(xué)特性作了大量研究，如耐旱特性的鑒定、耐冷、高產(chǎn)以及莖桿木質(zhì)化等性狀相關(guān)基因的 QTL 分析。然而，目前利用東鄉(xiāng)野生稻成功改良栽培稻數(shù)量性狀的報(bào)道仍很少。研究表明，限制野生種質(zhì)優(yōu)異基因利用的原因是多方面的。一方面是因?yàn)橐吧N中存在不良連鎖基因和不利農(nóng)藝性狀，加上所有平衡群體中野生種中不利基因高頻的出現(xiàn)、基因互作的增加、微效多基因效應(yīng)被掩蓋等缺點(diǎn)；另一方面，外源基因漸滲會(huì)導(dǎo)致受體植物出現(xiàn)廣泛的遺傳和表觀遺傳變化，因而在基因組和表型上表現(xiàn)出許多不穩(wěn)定現(xiàn)象，如丟失親本序列或出現(xiàn)新序列；轉(zhuǎn)座子活性等。這些遺傳和表觀遺傳學(xué)變異可在一定程度上導(dǎo)致種間雜種及其后代瘋狂分離，并很難在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定和純合，這在一定程度上阻礙了野生優(yōu)異基因在實(shí)際育種中的利用[25]。 針對(duì)上述制約野生稻種優(yōu)異基因挖掘和利用的瓶頸問題，本課題組對(duì)東鄉(xiāng)野生稻基因漸滲系BC1F9代的228個(gè)株系進(jìn)行SSAP分析，來揭示漸滲群體的遺傳多樣性，SSAP技術(shù)夠識(shí)別出逆轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)及其附近序列的多樣性，對(duì)各種植物的遺傳圖譜構(gòu)建、基因多態(tài)性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、植物進(jìn)化研究以及由逆轉(zhuǎn)座子導(dǎo)致的基因功能改變分析等方面的研究具有重要意義并為闡明東鄉(xiāng)野生稻漸滲誘發(fā)栽培稻遺傳和表觀遺傳變異機(jī)制奠定基礎(chǔ)