枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究(編輯修改稿)
2025-07-17 06:16 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 孢桿菌生產(chǎn)的，納豆中含有的納豆激酶對(duì)心血管疾病有很好的預(yù)防和治療作用。近年來，我國也掀起對(duì)納豆激酶的研究和開發(fā)熱潮，納豆激酶的藥用價(jià)值日益突出，在我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品豆豉中發(fā)現(xiàn)了類似納豆激酶的高活力的纖溶酶，將其產(chǎn)生菌株鑒定為枯草芽孢桿菌，并將豆豉纖溶酶基因克隆到了畢赤酵母中。同樣由枯草芽孢桿菌合成的聚谷氨酸也可用作藥物緩釋材料和醫(yī)用高分子纖維材料等 。6隨著人們對(duì)枯草芽孢桿菌性質(zhì)的深入，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有穩(wěn)定性好、抗性強(qiáng)、耐高溫、耐酸堿 [1]、抑制病原菌繁殖、 產(chǎn)生多種酶類、提高動(dòng)物消化酶活性、分解有機(jī)污染物、凈化水質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中；于此同時(shí)枯草芽孢桿菌又可以產(chǎn)生微生物源性抗菌蛋白 [2]；從而國內(nèi)外研究者掀起對(duì)拮抗菌株的篩選、鑒定以及其抗菌物質(zhì)理化特點(diǎn)等方面進(jìn)行了大量研究工作的熱潮，雖然在實(shí)際的應(yīng)用中，大多停留在實(shí)驗(yàn)室等機(jī)構(gòu)試驗(yàn)階段，但它所展現(xiàn)的應(yīng)用前景卻十分廣闊?？莶菅挎邨U菌在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件掌握不好，常出現(xiàn)活菌數(shù)量低、芽孢形成率低等問題，所以本課題嘗試通過改變 BPG 培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件來提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量，期望解決在現(xiàn)階段的工業(yè)化生產(chǎn)中存在著的菌數(shù)量低、成本高的問題。本課題是針對(duì)菌株適宜培養(yǎng)基的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。針對(duì)發(fā)酵液培養(yǎng)基中不同溫度、pH、菌種接種量、時(shí)間分別進(jìn)行單因素水平的試驗(yàn)，確定三個(gè)較好的水平，在進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)以確定枯草芽孢桿菌的最佳條件。對(duì)此我們對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。研究的目的是通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件，提高芽孢桿菌菌株發(fā)酵液的含菌量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，有助于降低生產(chǎn)成本。2 材 料 與 方 法 實(shí)驗(yàn)試劑與材料 材料枯草芽孢桿菌（湖南師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供） 實(shí)驗(yàn)試劑 牛肉膏；蛋白胨；葡萄糖；可溶性淀粉；氯化鈉；磷酸氫二鉀；硫酸錳；瓊脂；去離子水 主要儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)；滅菌鍋；培養(yǎng)皿若干；電子天平；250ml 錐形瓶若干；玻璃7棒；酒精燈；試管；移液管；移液槍；分光光度計(jì) 試驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)過程 曲線制備 → 單因素測定 → 正交試驗(yàn) 培養(yǎng)基及基礎(chǔ)條件確定 培養(yǎng)基 BPG 培養(yǎng)基 [22]：牛肉膏 、蛋白胨 、葡萄糖 、淀粉、Nacl 、KH 2PO4 、MnSO 47H2O ，加純化水定容至 1 000ml，調(diào) PH 值為 初始培養(yǎng)條件：接種量：510%；pH ：；溫度：30℃35 ℃；時(shí)間：1620 h。 比濁法測定細(xì)菌濃度比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中細(xì)胞的濃度與混濁度成正比，即與光密成正比，菌越多，光密度越大。因此用分光光度計(jì)在一定波長（420nm ）下，測定菌懸液的以光密度（即 OD 值）表示菌量?？莶菅挎邨U菌標(biāo)準(zhǔn)生長曲線的確定在 BPG 液體培養(yǎng)基上接種枯草芽孢桿菌原菌液，按優(yōu)化條件培養(yǎng)，并每隔 3h 取樣測定 OD 值和平板菌落計(jì)菌數(shù)。3 結(jié)果與分析 枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線在確定的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每隔 3 小時(shí)取樣測定 OD 值，并且通過平板菌落計(jì)菌數(shù)如下表一。時(shí)間（h）0 3 6 9 12 15 18 21 24OD 活菌數(shù)(107CFU/ml) 8OD 值與活菌數(shù)的關(guān)系如下圖 1。 從圖 1 可以看出 OD 值與活菌數(shù)呈現(xiàn)的關(guān)系，得到的關(guān)系式Y(jié)=108X+106 R2=。在 OD 值在小于 時(shí) OD 值和活菌數(shù)呈現(xiàn)線性的關(guān)系。 單因素試驗(yàn)結(jié)果 在確定BPG液體培養(yǎng)基的基本組成成分（、、100ml水）的前提下，通過四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)確定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氫鉀的最適含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長量的影響本實(shí)驗(yàn)選取 2345℃ 5 個(gè)溫度為培養(yǎng)溫度的變化來研究溫度對(duì)枯草芽孢桿菌的生長量的影響。培養(yǎng)基的接種量為 5%、初始 pH ，培養(yǎng)18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測定 OD420 值，根據(jù)最大生長量，選出最適溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表二及圖 2。表二 不同溫度對(duì)枯草芽孢桿菌的 OD420 值影響 溫度 OD420值25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃A1 A2 A3 9平均值 圖 2 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長量的影響 圖 2 顯示，當(dāng)溫度的變化分別為 25℃、30℃ 、35 ℃、40 ℃以及 45℃時(shí)，到的活菌數(shù)（10 7CFU/ml）分別為 、 、 以及 。所以有圖 2 分析可知，起初隨著溫度的升高，活菌數(shù)目會(huì)增加，當(dāng)溫度為 35℃時(shí)，枯草芽孢桿菌的數(shù)量達(dá)到最多；隨后繼續(xù)升高溫度，反而枯草芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。由于溫度對(duì)微生物生長的影響是影響在生物體內(nèi)所進(jìn)行的許多生化反應(yīng)，達(dá)到影響微生物的生長。在一定溫度范圍內(nèi)，生化反應(yīng)速率隨溫度上升而加快；超過一定限度，則細(xì)胞功能下降以至死亡。故此溫度的選擇為 35 ℃適宜。 pH 值對(duì)枯草芽孢桿菌生長量的影響 本實(shí)驗(yàn)選取 、 5 個(gè) PH 為培養(yǎng)時(shí) PH 的變化來研究 PH對(duì)枯草芽孢桿菌的生長量的影響。培養(yǎng)基的接種量為 5%、初始溫度 35℃，培養(yǎng) 18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測定 OD420 值，根據(jù)最大生長量，選出最適 PH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表三及圖 3。10表三不同 pH 對(duì)枯草芽孢桿菌的 OD420 值影響 pH 值 OD420值 A1 A2 A3 平均值 圖 3PH 對(duì)枯草芽孢桿菌生長量的影響 從圖 3 顯示，當(dāng) PH 變化分別為 8 以及 9 時(shí)，得到的活菌數(shù)為：（10 7CFU/ml）分別為 、 以及 。所以從圖3 直觀分析可知：開始隨著 PH 的增加，活菌數(shù)量呈現(xiàn)增加，
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