【文章內容簡介】 換，刀口要保持鋒利狀態(tài)，否則切割時會造成擠壓，引起周圍細胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。 ４．解剖針 解剖針用于深入到培養(yǎng)瓶中， 轉移細胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉。 第三節(jié) 培養(yǎng)條件 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、ＰＨ值、滲透壓等各種化學環(huán)境條件都會影響組培苗的生長和發(fā)育。 一、 溫度 溫度是組織培養(yǎng)過程中的重要因素。 組織培養(yǎng)在最適溫度下生長分化表現良好， 大多數組織培養(yǎng)都是在 23～ 27℃之間進行，很多研究者采用了 25177。２℃的恒溫條件。低于 15℃時培養(yǎng)，組織會表現生長停止，高于 35℃時對生長不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是 20℃、月季是 25～ 27℃、番茄是 28℃。 溫度不僅影響組培苗的生長速度， 也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進程。如煙草芽的形成以 28℃為最好， 在 12℃以下， 33℃以上形成率皆最低。 不同培養(yǎng)目標采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在 30℃下再生 的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在 25℃下的高。 桃胚在 2～ 5℃條件進行一定時間的低溫處理， 有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用 35℃處理草莓的莖尖分生組織 3～ 5天，可得到無病毒苗。 二、光照 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一， 主要表現在光強、光質、以及光照時間方面： 1．光照強度 光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響， 從目前的研究情況看，光照強度對外植體、細胞的最初分裂有明顯的影響。 一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。 2．光質 光質對愈傷組織誘導，培養(yǎng)組織的 增殖以及器官的分化都有明顯的影響。 如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，８周后，分化出愈傷組織。但在藍光下， 幾周后才出現愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種 15 天后，在藍光下培養(yǎng)首先出現芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。 3．光周期 試管苗培養(yǎng)時要選用一定的光暗周期來進行組織培養(yǎng)， 最常用的周期是 16小時的光照， ８小時的黑暗，研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織， 在短日照下易分化，而在長日照下產生愈傷組織，有時需要暗培養(yǎng)， 尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏桕樹的愈傷組織。 三、濕度 濕度的 影響包括培養(yǎng)容器和環(huán)境的濕度條件， 容器內主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。 前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應適當減少瓊脂用量， 否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進培養(yǎng)基， 導致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內濕度情況，但封閉度較高的封口材料易引起通透性受阻，也導致生長發(fā)育受影響。 環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)， 一般要求７０～８０％的相對濕度， 常用加濕器或經常灑水的方法來調節(jié)濕度。濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高 ,進而影響組織培養(yǎng)的正常進行；過高時，易引起棉塞長霉，造成污染。 三、滲透壓 培養(yǎng)基中添加的鹽類、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇類高分子化合物，影響到滲透壓的變化。 １～２個大氣壓對生長有促進作用，２個大氣壓以上就對生長有阻礙作用， ５～６個大氣壓生長就完全停止，６個大氣壓細胞就不能生存。 四、 pＨ值 不同的植物對培養(yǎng)基最適 pＨ值的要求也是不同的（表 2１），大多在５～６ .５左右，一般培養(yǎng)基皆掌握在５ .８，這基本能適應大多植物培養(yǎng)的需要。 表 2１ 不同植物的最適 pＨ值 種 類 最適 PH 值 種 類 最適 PH 值 杜 鵑 4． 0 月 季 5． 8 越 桔 4． 5 胡蘿卜、石刁柏 6． 0 蠶 豆 5． 5 桃 7． 0 番茄、葡萄 5． 7 pＨ值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣， 后者較高一些。一般來說當ＰＨ高于６ .５時，培養(yǎng)基全變硬；低于５時，瓊脂不能很好地凝固。因為高溫滅菌會降低 pＨ值（約０ .２～０ .３個 pＨ） 因此在配制時常提高 pＨ值０ .２～０ .３單位。 pＨ值大小調整可用０ .１Ｍ的Ｎ aＯＨ和０ .１Ｍ的ＨＣ l來調整。１ ml的Ｎ aＯＨ可使 pＨ值升高０ .２單 位，１ ml 的 HCL 可使值降低０ .２單位。調節(jié)時一定要充分攪拌均勻。 五、氣體 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素， 瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。 通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥， 夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度 ,以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經常換氣，改善室內的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振蕩的次數、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。 本章小結 1．植物組織培養(yǎng)實驗室一般由洗滌室、配置室、接種室和培養(yǎng)室構成。其中，接種室是一個最為重要的操作室。 2．植物組 織培養(yǎng)常用的設備和器材有：玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；器械用具，如鑷子、剪刀、解剖刀、解剖針等；儀器設備，如超凈工作臺、冰箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱等。 3．溫度、光照、氧氣、 PH、濕度都會影響到組織培養(yǎng)成功率，因此，實際培養(yǎng)外植體時，要根據不同的植物材料，將上述因素調整到適宜的范圍。 復習思考題 1．因地制宜建一個組織培養(yǎng)實驗室，需要哪些組成部分？各部分的作用是什么？ 2．常規(guī)組織培養(yǎng)時，需要什么設備和器械？你是否會用？ 3．組織培養(yǎng)中， PH 有什么作用？如果 PH 過高或過低會有什么后果？ AAAA4．談談組織培養(yǎng)中如何根據外植體的不同調整適宜的培養(yǎng)溫度？ 第三章 培養(yǎng)基 目的要求： 1．一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點和各自的作用 2．掌握基本培養(yǎng)基的配方 3．一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量 4．掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟 5．熟練掌握培養(yǎng)基的分裝和滅菌方法 6．一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒 有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。在植物組織培養(yǎng)歷史進程中，事實上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。對植物的營養(yǎng)要求的不斷認識，對已有培養(yǎng)基的改進，或者將新發(fā)現的植物激素、新的有益成分應用于培養(yǎng)基之中，都大大促進了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展，取得越來越多的成功。 一、培養(yǎng)基的種類 培養(yǎng)基有許多種類，根據不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的產生最早是Ｓ acks(1680)和Ｋ nop(1681)，他們對綠色 植物的成分進行了分析研究， 根據植物從土中主要是吸收無機鹽營養(yǎng)，設計出了由無機鹽組成的Ｓ acks 和Ｋ nop 溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養(yǎng)基得到廣泛應用。 以后根據不同目的進行改良產生了多種培養(yǎng)基， Ｗ hite 培養(yǎng)基在四十年代用得較多，現在還常用。而到 60 和 70年代則大多采用ＭＳ等高濃度培養(yǎng)基， 可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要， 并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入 ,也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。 培養(yǎng)基的名稱，一直根據沿用的習慣。多數以發(fā)明人的名字來命名， 如Ｗhite 培養(yǎng)基 ，Ｍ urashige 和Ｓ koog 培養(yǎng)基（簡稱ＭＳ 培養(yǎng)基），也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。 目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種。常用的培養(yǎng)基及特點如下： １．ＭＳ培養(yǎng)基 它是 1962 年由Ｍ urashige 和Ｓ koog 為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。 特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數量和比例較合適， 可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其它培養(yǎng)基為高， 廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。 ２．Ｂ 5培養(yǎng)基 是 1968 年由Ｇ amB 等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。 其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在Ｂ 5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。 ３．Ｗ hite 培養(yǎng)基 是 1943 年由Ｗ hite 為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。 1963年又作了改良，稱作Ｗ hite 改良培養(yǎng)基，提高了Ｍ gＳＯ 4 的濃度和 增加了硼素。其特點是無機鹽數量較低，適于生根培養(yǎng)。 ４．Ｎ 6培養(yǎng)基 是 1974 年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的。 其特點是成分較簡單，ＫＮＯ 3 和（ＮＨ 4） 2ＳＯ 4含量高。在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)和其它組織培養(yǎng)。 ５．ＫＭ－８Ｐ培養(yǎng)基 它是 1974 年為原生質體培養(yǎng)而設計的。 其特點是有機成分較復雜。它包括了所有的單糖和維生素。廣泛用于原生質體和融合體的培養(yǎng)。常用培養(yǎng)配方如下： 表 3－ 1 MS 和 White 培養(yǎng)基配方表 有機物 ＭＳ (毫克 /升 ) Ｗ hite (毫克 /升 ) ＮＨ 4ＮＯ 3 １６５０ ＫＮＯ 3 １９００ ８０ Ｃ aＣ l2 ２Ｈ 2Ｏ 4４０ Ｍ gＳＯ 4 ７Ｈ 2Ｏ ３７０ ７２０ Ｋ H2ＰＯ 4 １７０ Ｆ eＳＯ 4 ７Ｈ 2Ｏ ２８ .７ Ｎ a2ＥＤＴＡ ３７ .３ Ｍ nＳＯ 4 Ｈ 2Ｏ ２２ .３ ７ Ｚ nＳＯ ４ ７Ｈ 2Ｏ Ｃ oＣ l2 ６Ｈ 2Ｏ Ｃ uＳＯ 4 ５Ｈ 2Ｏ ０ .０３ Ｎ a2Ｍ oＯ 4 ２Ｈ 2Ｏ 0． 25 H3BO3 ＫＩ ０ .８３ ０ .７５ 煙酸 (Vpp) ０ .５ ０ .５ 鹽酸吡多醇 (VB6) 0． 5 0． 1 鹽酸硫胺素 (VB1) ０ .１ ０ .１ 肌醇 100 甘氨酸 2 3 二、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、 無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。 １．水 水是植物原生質體的組成成分， 也是一切代謝過程的介質和溶媒。 它是生命活動過程中不可缺少的物質。 配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質。大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成份的變化引 起不良效果。 ２．無機元素 大量元素，指濃度大于 ，有Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃ a、Ｍ g、Ｓ等。其作用是： (1)氮 是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分， 是生命不可缺少的物質。在制備培養(yǎng)基時以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式供應。大多數培養(yǎng)基既含有硝態(tài)氮又含銨態(tài)氮。銨態(tài)氮對植物生長較為有利。 供應的氮化物有硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀等。有時，也添加氨基酸來補充氮素。 (2)磷 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質、細胞核的重要組成部分。磷也是ＡＴＰ、ＡＤＰ等的組成成分。在植物組織培 養(yǎng)過程中， 向培養(yǎng)基內添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進對Ｎ的吸收， 增加蛋白質在植物體中的積累。常用于培養(yǎng)基的磷化物有ＫＨ 2ＰＯ 4 或Ｎ aＨ 2ＰＯ 4等。 (3)鉀 是植物營養(yǎng)Ｎ、Ｐ、Ｋ之一。Ｋ對碳水化合物合成、轉移、以及氮素代謝等有密切關系。Ｋ增加時，蛋白質合成增加， 維管束、纖維組織發(fā)達，對胚的分化有促進作用。但濃度不易過大，一般為１～３ mg/l 為好。制備培養(yǎng)基時，常以ＫＣ L、ＫＮＯ 3 等鹽類提供。 (4) Ｍ g、Ｓ和Ｃ a Ｍ g是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；Ｓ是含Ｓ蛋白質的組成成分。它 們常以Ｍ gＳＯ 4 7Ｈ 2Ｏ提供。用量為１～３ mg/l較為適宜； Ｃ a 是構成細胞壁的一種成分，Ｃ a對細胞分裂、保護質膜不受破壞有顯著作用，常以Ｃ aＣ l2２Ｈ 2Ｏ提供。 (5)微量元素 指小于 ， Ｆ e、Ｂ、Ｍ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o等。 鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時， 它又是葉綠素形成的必要條件。 培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用。 在制做培養(yǎng)基時不用Ｆ e2（ＳＯ 4） 3和Ｆ eＣ l3 （因其在 pH５ .２以上，易形成Ｆ e（ＯＨ） 3的不溶性沉 淀），而用 Ｆ e ＳＯ 4７Ｈ 2Ｏ和 Ｎa2ＥＤＴＡ結合成螯合物使用。Ｂ、Ｍ n、Ｚ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o 等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質會導致生長，分裂異常。 總之，植物必需營養(yǎng)元素可組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質。也可構成一些特殊的生理活性物質，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，還在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學