【導(dǎo)讀】植物體的一部分在無(wú)菌條件下培養(yǎng)的技術(shù)。通常我們所說(shuō)的廣義的組織培養(yǎng)，是指通過(guò)無(wú)菌操作分離植物體的一部分，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生成完整的植株。珠、胚、子房、果實(shí)等外植體的培養(yǎng)。組織進(jìn)行培養(yǎng)，二者均通過(guò)再分化誘導(dǎo)形成植株。得到的能保持較好分散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。源激素的應(yīng)用，使組織培養(yǎng)不僅從理論上為相關(guān)學(xué)科提出了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，植物組織培養(yǎng)之所以發(fā)展如此快，應(yīng)用的范圍如此廣泛，是由。生產(chǎn)，故總體來(lái)說(shuō)成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。被定名為White培養(yǎng)基。成芽，從而明確了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。官分化的激素模式變?yōu)榧?dòng)素與生長(zhǎng)素的比例關(guān)系。的大麗花中首次獲得無(wú)病毒植株。細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。這方面中國(guó)學(xué)者作出了重要貢獻(xiàn)。motel提出了一個(gè)離體無(wú)性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。

　　

【正文】 以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。 下面以ＭＳ培養(yǎng)基制備為例，來(lái)概述其制備方法。 1．大量元素母液可配成 10 倍液。用分析天平按表 3－ 2 稱取藥品，分別加100ml 左右蒸餾水溶解后，再用磁力攪拌器攪拌，促進(jìn)溶解。注意 Ca2+和 PO43一起混合易發(fā)生沉淀。然后倒入 1000ml 定容瓶中，再加水定容至刻度，即成為１０倍母液。 2．微量元素母液 可配成 100 倍液。用分析 天平按表準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至 1000ml。 3．鐵鹽母液 可配成 100 倍液，按表稱取藥品，加熱溶解， 混合后加水定容至 1000ml 。 4．維生素、氨基酸母液 可配成 1mg/ml 母液。按表稱取藥品，溶解，分別加水定容至 100ml ，其中肌醇為１０ mg/ml 的濃度。 5．激素母液的配制 每種激素必須單獨(dú)配成母液，濃度一般配成 1mg/ml。用時(shí)根據(jù)需要取用。因?yàn)榧に赜昧枯^少，一次可配成５０ ml 或１００ ml。另外，多數(shù)激素難溶于水，要先溶于可溶物質(zhì)。然后才能加水定容。它們的配法如下： I AA、 IBA、 GA 先溶于少量的９５％的酒精中．再加水定容到一定濃度。 NAA 可溶于熱水或少量９５％的酒精中，再加水定容到一定濃度。 2,4D可用少量 NaOH 溶解后，再加水定容到濃度。 Kt和 BA先溶于少量 1mol 的 HCl 中再加水定容。 玉米素先溶于少量９５％的酒精中，再加熱水到一定濃度。 配制好的母液瓶上應(yīng)分別貼標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配一升培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)取的量。 二、培養(yǎng)基的配制 按表用量筒移取大量元素母液 100ml，用專一對(duì)應(yīng)的移液管分別吸取微量元素母液 10ml、鐵鹽母液 10ml、肌醇母液１ ０ ml、甘氨酸母液 2ml、 VB1 ml、VB6 、 Vpp 。均置入１０００ ml定容瓶中 ,若不加任何激素，則為ＭＳ０培養(yǎng)基；若需加激素按配方移取激素母液即可。 將已裝母液的定容瓶用蒸餾水或自來(lái)水定容到１０００ ml，?。保匙笥业谷胄′X鍋中加熱。同時(shí)，稱好３０克蔗糖，稱瓊脂絲７克（或瓊脂粉），也傾入小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，防止糊底。旺火煮開(kāi)，再用文火融化瓊脂。，直至瓊脂全部融化即清澈見(jiàn)底為度。若用瓊脂粉，應(yīng)加入 100ml 左右的液體培養(yǎng)基，并攪拌均勻。然后再傾入定容瓶余下的液體培養(yǎng)基。 搖晃均勻即可。 培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整 PH值。用 的 NaOH 或 HCl 液調(diào)到 左右。在培養(yǎng)基配方不大變動(dòng)的情況下可用經(jīng)驗(yàn)法。即將連續(xù)三次測(cè)定所加的酸或堿液的平均值作為以后調(diào)整的用量值。加后，一定要搖動(dòng)均勻。還要注意酸或堿液不要放置時(shí)間太久。 表 3－ 2 ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制 化 合 物 名 稱 規(guī)定量 擴(kuò)大 倍數(shù) 稱取量 母液 體積 1L 培養(yǎng)基 移取量 ＮＨ 4ＮＯ 3 1650 10 16500 1000 100 母 液 1 ＫＮＯ 3 １９００ 1900 10 19000 CaCl 2H2O 440 10 4400 MgSO4 7H2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 MnSO4 H2O 100 2230 母 ZnSO4 7H2O 100 860 1000 100 液 2 CoCl 6H2O 100 CuSO4 5H2O 100 25 H3BO3 100 620 Na2MO4 2H2O 100 25 KI 100 83 FeSO4 7H2O 100 2870 Na2EDTA 100 3730 煙酸 (Vpp) 50 25 500 10 母 液 3 鹽酸吡 多醇 50 25 鹽酸硫 胺素 50 5 肌醇 100 50 5000 甘氨酸 2 50 100 四、培養(yǎng)基的分裝與滅菌 培養(yǎng)基合成后， 要趁熱分裝， 100ml 的容器約裝入 3040ml 培養(yǎng)基，即 1升培養(yǎng)基約裝 35 瓶左右。太多則浪費(fèi)培養(yǎng)基，太少不易接種和影響生長(zhǎng)。但要根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象來(lái)決定。如果培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基；生根等短期培養(yǎng)時(shí)，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時(shí)不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后容易污染。裝后用封口材料包上瓶口，扎口后，寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免產(chǎn)生污染 。 培養(yǎng)基用高壓滅菌。打開(kāi)鍋蓋，加水至水位線。把已裝好培養(yǎng)基的三角瓶，連同蒸餾水及接種用具等放入鍋筒內(nèi)，裝時(shí)不要過(guò)分傾斜培養(yǎng)基，以免弄到瓶口上或流 出。然后蓋上鍋蓋，對(duì)角旋緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至 時(shí)，打開(kāi)放氣閥放氣，回“ 0”后關(guān)閉放氣閥。當(dāng)氣壓上升到 時(shí)，保壓滅菌20分鐘，到時(shí)停止加熱。當(dāng)氣壓回 0 后打開(kāi)鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺(tái)上冷凝。滅好的培養(yǎng)費(fèi)基不要放置時(shí)間太長(zhǎng)，最多不能超過(guò) 1周。 第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基（如 MS 培養(yǎng)基或 B5 培養(yǎng)基）開(kāi)始。當(dāng)通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到一種能滿足 實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基。選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。 一、單因子試驗(yàn) 單因子試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中其它成分都維持在一般水平上，只變動(dòng)一個(gè)因子，以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度，例如 MS基本培養(yǎng)基的其它成分和用量都不變，只變動(dòng) NAA 用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。 生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性增加，對(duì)照組也可能有一組以上。要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中 的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其它培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來(lái)源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料不一致導(dǎo)致的。 試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有 4～ 10瓶，每瓶至少 3 塊培養(yǎng)物或 3 叢小幼苗。 二、多因子試驗(yàn) 對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合， 如研究 NAA 和6BA 的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè) 5個(gè)濃度水平（ 0、 、 、 10?mol/l），這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有 25項(xiàng)處理的試驗(yàn)（表 3－ 3）。 完全試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子越多，處理數(shù)越多，試驗(yàn)越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用正交試驗(yàn)。例如，采用正交設(shè)計(jì)，在使用此表時(shí)就可以安排 4 個(gè)因子， 3種水平的試驗(yàn)，一共做 9種不同搭配的試驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了 27次種種搭配的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分 析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無(wú)誤地表現(xiàn)出來(lái)。因此一次系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，就可以把問(wèn)題分析得清清楚楚，用有限的時(shí)間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時(shí)探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、糖和其它成分的用量。 表 3－ 3 2 種激素 5 種濃度的實(shí)驗(yàn)組合 6BA（μmol/l） 0 5 10 NAA （μmol/l） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 三、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法 在植物組織分化與再生的研究中，在沒(méi)有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時(shí)是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時(shí)是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡(jiǎn)化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。此外，還有廣譜實(shí)驗(yàn)法等。 本章小結(jié) 1．培養(yǎng)基多以命名人的名字命名。目前，比較流行的培養(yǎng) 基有： MS培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高； B5 培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是含有較低的銨； White培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽低，適于生根； N6培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是 KNO3 和（ NH4）2SO4 含量較高，適于花藥培養(yǎng)； KM－ 8P培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較多，適于原生質(zhì)體培養(yǎng)。 2．水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物質(zhì)、天然復(fù)合物、凝固劑是構(gòu)成培養(yǎng)基的五種主要成分。這五種成分有各自的作用效果和要求。 3．配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素 10 倍液，定容至 1000ml；微量元素 100 倍液，定容至 1000ml；鐵 鹽 100倍液，定容至 1000ml；維生素 1mg? l，定容至 100ml；激素 1mg? l，定容至 50～100ml。 4．培養(yǎng)基分裝到 100ml 的三角瓶，用量一般為每瓶 30～ 40ml，過(guò)多造成浪費(fèi)，過(guò)少則不利于植物的生長(zhǎng)；高壓滅菌時(shí)，壓力通常為 0。 10Mpa， 20分鐘。 5．篩選合適的培養(yǎng)基一般有四種方法，即單因子試驗(yàn)法、多因子試驗(yàn)法、逐步添加和排除法以及廣譜實(shí)驗(yàn)法。其中，第一種方法比較簡(jiǎn)單，第二種方法比較準(zhǔn)確，而后兩種方法則比較復(fù)雜。 復(fù)習(xí)思考題 1．目前，常用的培養(yǎng)基有哪些？各有什么特點(diǎn)？ 2．培養(yǎng)基包括哪些 成分？各有什么作用和適宜濃度范圍？ 3．請(qǐng)回答 MS 培養(yǎng)基的基本構(gòu)成？ 4．配制培養(yǎng)基時(shí)，為什么要先配母液？如何配制母液？ 5．怎樣利用母液配制應(yīng)用培養(yǎng)基？ 6．培養(yǎng)基內(nèi)加入活性炭的目的是什么？應(yīng)注意什么問(wèn)題？ 7．實(shí)際使用培養(yǎng)基時(shí)，為什么通常需加入一定量的植物生長(zhǎng)物質(zhì)？ 8．怎樣進(jìn)行培養(yǎng)基的濕熱滅菌？ 9．試比較選擇培養(yǎng)基時(shí)，幾種方法的優(yōu)劣？ 第四章 操作技術(shù) 目的要求： 1．一般掌握滅菌和消毒的區(qū)別 2．掌握滅菌的方法和具體操作過(guò)程 3．掌握無(wú)菌接種的步驟 4．掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟 5． 一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法 6．掌握試管苗馴化的基本程序 7．一般掌握快速繁殖試管苗的計(jì)劃安排及增殖倍數(shù)計(jì)算方法 第一節(jié) 滅菌和接種 一、滅菌 滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無(wú)菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無(wú)菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。 這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其它微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在，無(wú)時(shí)不有，無(wú)孔不入。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。 無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其它物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體 (當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的 )，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。從以上可以看出：在地球表面無(wú)菌世界要比有菌世界小得多。 滅菌是指用物理或化學(xué) 的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過(guò)消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。而通過(guò)嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種室、超凈臺(tái)、等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行操作，就叫做無(wú)菌操作。 植物組織培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，甚至超過(guò)微生物的培養(yǎng)要求，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，稍不小 心就引起雜菌污染。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對(duì)象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(zhǎng)。 常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（超聲波、微波）、過(guò)濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等措施?；瘜W(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。 1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌 培養(yǎng)基在制備后的 24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序 。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在 的