【導(dǎo)讀】植物體的一部分在無菌條件下培養(yǎng)的技術(shù)。通常我們所說的廣義的組織培養(yǎng)，是指通過無菌操作分離植物體的一部分，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進行培養(yǎng)，使其生成完整的植株。珠、胚、子房、果實等外植體的培養(yǎng)。組織進行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。得到的能保持較好分散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團的培養(yǎng)。源激素的應(yīng)用，使組織培養(yǎng)不僅從理論上為相關(guān)學(xué)科提出了可靠的實驗證據(jù)，植物組織培養(yǎng)之所以發(fā)展如此快，應(yīng)用的范圍如此廣泛，是由。生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。被定名為White培養(yǎng)基。成芽，從而明確了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。官分化的激素模式變?yōu)榧铀嘏c生長素的比例關(guān)系。的大麗花中首次獲得無病毒植株。細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。這方面中國學(xué)者作出了重要貢獻。motel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。

　　

【正文】 以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。 下面以ＭＳ培養(yǎng)基制備為例，來概述其制備方法。 1．大量元素母液可配成 10 倍液。用分析天平按表 3－ 2 稱取藥品，分別加100ml 左右蒸餾水溶解后，再用磁力攪拌器攪拌，促進溶解。注意 Ca2+和 PO43一起混合易發(fā)生沉淀。然后倒入 1000ml 定容瓶中，再加水定容至刻度，即成為１０倍母液。 2．微量元素母液 可配成 100 倍液。用分析 天平按表準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至 1000ml。 3．鐵鹽母液 可配成 100 倍液，按表稱取藥品，加熱溶解， 混合后加水定容至 1000ml 。 4．維生素、氨基酸母液 可配成 1mg/ml 母液。按表稱取藥品，溶解，分別加水定容至 100ml ，其中肌醇為１０ mg/ml 的濃度。 5．激素母液的配制 每種激素必須單獨配成母液，濃度一般配成 1mg/ml。用時根據(jù)需要取用。因為激素用量較少，一次可配成５０ ml 或１００ ml。另外，多數(shù)激素難溶于水，要先溶于可溶物質(zhì)。然后才能加水定容。它們的配法如下： I AA、 IBA、 GA 先溶于少量的９５％的酒精中．再加水定容到一定濃度。 NAA 可溶于熱水或少量９５％的酒精中，再加水定容到一定濃度。 2,4D可用少量 NaOH 溶解后，再加水定容到濃度。 Kt和 BA先溶于少量 1mol 的 HCl 中再加水定容。 玉米素先溶于少量９５％的酒精中，再加熱水到一定濃度。 配制好的母液瓶上應(yīng)分別貼標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配一升培養(yǎng)基時應(yīng)取的量。 二、培養(yǎng)基的配制 按表用量筒移取大量元素母液 100ml，用專一對應(yīng)的移液管分別吸取微量元素母液 10ml、鐵鹽母液 10ml、肌醇母液１ ０ ml、甘氨酸母液 2ml、 VB1 ml、VB6 、 Vpp 。均置入１０００ ml定容瓶中 ,若不加任何激素，則為ＭＳ０培養(yǎng)基；若需加激素按配方移取激素母液即可。 將已裝母液的定容瓶用蒸餾水或自來水定容到１０００ ml，取１／３左右倒入小鋁鍋中加熱。同時，稱好３０克蔗糖，稱瓊脂絲７克（或瓊脂粉），也傾入小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，防止糊底。旺火煮開，再用文火融化瓊脂。，直至瓊脂全部融化即清澈見底為度。若用瓊脂粉，應(yīng)加入 100ml 左右的液體培養(yǎng)基，并攪拌均勻。然后再傾入定容瓶余下的液體培養(yǎng)基。 搖晃均勻即可。 培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整 PH值。用 的 NaOH 或 HCl 液調(diào)到 左右。在培養(yǎng)基配方不大變動的情況下可用經(jīng)驗法。即將連續(xù)三次測定所加的酸或堿液的平均值作為以后調(diào)整的用量值。加后，一定要搖動均勻。還要注意酸或堿液不要放置時間太久。 表 3－ 2 ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制 化 合 物 名 稱 規(guī)定量 擴大 倍數(shù) 稱取量 母液 體積 1L 培養(yǎng)基 移取量 ＮＨ 4ＮＯ 3 1650 10 16500 1000 100 母 液 1 ＫＮＯ 3 １９００ 1900 10 19000 CaCl 2H2O 440 10 4400 MgSO4 7H2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 MnSO4 H2O 100 2230 母 ZnSO4 7H2O 100 860 1000 100 液 2 CoCl 6H2O 100 CuSO4 5H2O 100 25 H3BO3 100 620 Na2MO4 2H2O 100 25 KI 100 83 FeSO4 7H2O 100 2870 Na2EDTA 100 3730 煙酸 (Vpp) 50 25 500 10 母 液 3 鹽酸吡 多醇 50 25 鹽酸硫 胺素 50 5 肌醇 100 50 5000 甘氨酸 2 50 100 四、培養(yǎng)基的分裝與滅菌 培養(yǎng)基合成后， 要趁熱分裝， 100ml 的容器約裝入 3040ml 培養(yǎng)基，即 1升培養(yǎng)基約裝 35 瓶左右。太多則浪費培養(yǎng)基，太少不易接種和影響生長。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。如果培養(yǎng)時間較長時，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基；生根等短期培養(yǎng)時，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后容易污染。裝后用封口材料包上瓶口，扎口后，寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時間過長，以免產(chǎn)生污染 。 培養(yǎng)基用高壓滅菌。打開鍋蓋，加水至水位線。把已裝好培養(yǎng)基的三角瓶，連同蒸餾水及接種用具等放入鍋筒內(nèi)，裝時不要過分傾斜培養(yǎng)基，以免弄到瓶口上或流 出。然后蓋上鍋蓋，對角旋緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至 時，打開放氣閥放氣，回“ 0”后關(guān)閉放氣閥。當(dāng)氣壓上升到 時，保壓滅菌20分鐘，到時停止加熱。當(dāng)氣壓回 0 后打開鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺上冷凝。滅好的培養(yǎng)費基不要放置時間太長，最多不能超過 1周。 第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基（如 MS 培養(yǎng)基或 B5 培養(yǎng)基）開始。當(dāng)通過一系列的實驗，對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足 實驗需要的新培養(yǎng)基。選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗方法主要有單因子試驗、多因子試驗及廣譜實驗等。 一、單因子試驗 單因子試驗中，培養(yǎng)基中其它成分都維持在一般水平上，只變動一個因子，以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度，例如 MS基本培養(yǎng)基的其它成分和用量都不變，只變動 NAA 用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。 生物學(xué)試驗不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗中必需設(shè)置對照組與試驗組，試驗組可以有一組或幾組，隨試驗的復(fù)雜性增加，對照組也可能有一組以上。要求對照組與試驗組中 的試驗個體，即植物組織塊或其它培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗結(jié)果是來源于試驗因子，而不是由于試驗材料不一致導(dǎo)致的。 試驗中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗結(jié)果。隨試驗規(guī)模和要求不同，大多每個項目要有 4～ 10瓶，每瓶至少 3 塊培養(yǎng)物或 3 叢小幼苗。 二、多因子試驗 對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案，也可選用正交設(shè)計方案，完全試驗方案具有均衡完全的特點，各個因子的每個水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合， 如研究 NAA 和6BA 的最佳濃度組合，每個因子各設(shè) 5個濃度水平（ 0、 、 、 10?mol/l），這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個具有 25項處理的試驗（表 3－ 3）。 完全試驗方案試驗因子越多，處理數(shù)越多，試驗越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗信息，通常采用正交試驗。例如，采用正交設(shè)計，在使用此表時就可以安排 4 個因子， 3種水平的試驗，一共做 9種不同搭配的試驗，其結(jié)果相當(dāng)于做了 27次種種搭配的試驗。正交試驗雖然是多因素搭配在一起的試驗，但是在試驗結(jié)果的分 析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現(xiàn)出來。因此一次系統(tǒng)的試驗結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長素、糖和其它成分的用量。 表 3－ 3 2 種激素 5 種濃度的實驗組合 6BA（μmol/l） 0 5 10 NAA （μmol/l） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 三、逐步添加和逐步排除的試驗方法 在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機營養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時是使試驗成功，在逐步減少時是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡單方法。此外，還有廣譜實驗法等。 本章小結(jié) 1．培養(yǎng)基多以命名人的名字命名。目前，比較流行的培養(yǎng) 基有： MS培養(yǎng)基，其特點是無機鹽和離子濃度較高； B5 培養(yǎng)基，其特點是含有較低的銨； White培養(yǎng)基，其特點是無機鹽低，適于生根； N6培養(yǎng)基，其特點是 KNO3 和（ NH4）2SO4 含量較高，適于花藥培養(yǎng)； KM－ 8P培養(yǎng)基，其特點是有機成分較多，適于原生質(zhì)體培養(yǎng)。 2．水、無機鹽、有機物質(zhì)、天然復(fù)合物、凝固劑是構(gòu)成培養(yǎng)基的五種主要成分。這五種成分有各自的作用效果和要求。 3．配制培養(yǎng)基時，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素 10 倍液，定容至 1000ml；微量元素 100 倍液，定容至 1000ml；鐵 鹽 100倍液，定容至 1000ml；維生素 1mg? l，定容至 100ml；激素 1mg? l，定容至 50～100ml。 4．培養(yǎng)基分裝到 100ml 的三角瓶，用量一般為每瓶 30～ 40ml，過多造成浪費，過少則不利于植物的生長；高壓滅菌時，壓力通常為 0。 10Mpa， 20分鐘。 5．篩選合適的培養(yǎng)基一般有四種方法，即單因子試驗法、多因子試驗法、逐步添加和排除法以及廣譜實驗法。其中，第一種方法比較簡單，第二種方法比較準(zhǔn)確，而后兩種方法則比較復(fù)雜。 復(fù)習(xí)思考題 1．目前，常用的培養(yǎng)基有哪些？各有什么特點？ 2．培養(yǎng)基包括哪些 成分？各有什么作用和適宜濃度范圍？ 3．請回答 MS 培養(yǎng)基的基本構(gòu)成？ 4．配制培養(yǎng)基時，為什么要先配母液？如何配制母液？ 5．怎樣利用母液配制應(yīng)用培養(yǎng)基？ 6．培養(yǎng)基內(nèi)加入活性炭的目的是什么？應(yīng)注意什么問題？ 7．實際使用培養(yǎng)基時，為什么通常需加入一定量的植物生長物質(zhì)？ 8．怎樣進行培養(yǎng)基的濕熱滅菌？ 9．試比較選擇培養(yǎng)基時，幾種方法的優(yōu)劣？ 第四章 操作技術(shù) 目的要求： 1．一般掌握滅菌和消毒的區(qū)別 2．掌握滅菌的方法和具體操作過程 3．掌握無菌接種的步驟 4．掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟 5． 一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法 6．掌握試管苗馴化的基本程序 7．一般掌握快速繁殖試管苗的計劃安排及增殖倍數(shù)計算方法 第一節(jié) 滅菌和接種 一、滅菌 滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。 這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其它微生物。菌的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。 無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其它物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體 (當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的 )，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。 滅菌是指用物理或化學(xué) 的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。而通過嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種室、超凈臺、等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行操作，就叫做無菌操作。 植物組織培養(yǎng)對無菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因為培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)，稍不小 心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。 常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施?；瘜W(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。 1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌 培養(yǎng)基在制備后的 24小時內(nèi)完成滅菌工序 。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在 的