【文章內(nèi)容簡介】 鐘。，加110ul無水乙醇，蓋上管蓋，振蕩混勻。（負(fù)壓法）（離心法） 負(fù)壓法 ，固定在負(fù)壓裝置上。 ，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。 [樣品處理液B]，開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。 [樣品處理液C]，開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。 ，將其放人2ml離心管中，14000rpm離心1分鐘。 ，小心將30ul[滅菌純化水]加在柱面中央，靜置1分鐘。 l0000rpm離心1分鐘，取2ml離心管中的收集液l2ul做PCR反應(yīng)模板。 離心法 。 l0000rpm離心1分鐘。 ，加入500ul[樣品處理液B]，l0000rpm離心1分鐘。 ，加入500ul[樣品處理液C]，l0000rpm離心1分鐘。 2. 16將提取柱放入一新的2ml離心管中，14000rpm離心1分鐘。 ，小心將50ul[滅菌純化水】加在柱面中央，靜置1分鐘。 l0000rpm離心1分鐘，取2ml離心管中的收集液12ul做PCR反應(yīng)模板。f）收拾臺(tái)面至準(zhǔn)備狀態(tài)。 結(jié)核桿菌（痰液）a）取晨痰加入2倍體積4％氫氧化鈉待其充分液化(30分鐘)，液化過程中，振蕩2～3次，如痰液粘稠，可延長液化時(shí)間。b）取1 ，15000轉(zhuǎn)離心10分鐘。c）棄上清留沉淀，加入1mlTE液混勻，15000 轉(zhuǎn) 10分鐘離心，棄上清液。d）重復(fù)c操作，留沉淀，加入50181。l TB DNA提取液，振蕩混勻。e）100度沸水浴15分鐘，15000轉(zhuǎn)離心10分鐘備用f）取上清7181。l點(diǎn)樣上機(jī)。 沙眼衣原體和解脲支原體（分泌物）a），在試管壁上擠干后丟棄。b），用于檢測。c），再加入100181。l被測樣本。d）蓋上管蓋，振蕩混勻，13000rpm離心10分鐘。e）吸棄上清，向沉淀中加入50181。l樣品處理液B，振蕩混勻低速（2000rpm）離心數(shù)秒后，100度干浴或沸水浴10分鐘。f）13000rpm離心10分鐘，取2181。l上清為PCR反應(yīng)模板。（上清液不立即使用，須置20度保存，重新使用時(shí)需13000 rpm 離心10分鐘。）檢測結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化；保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性，準(zhǔn)確判斷實(shí)驗(yàn)失控的原因，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的可靠程度。 本規(guī)則適用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)》　申子瑜　李金明主編　人民衛(wèi)生出版社出版2002年第一版；試劑使用說明書 由經(jīng)培訓(xùn)合格的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員負(fù)責(zé)操作。 ，應(yīng)按以下步驟進(jìn)行：全部曲線——陰性對(duì)照——陽性室內(nèi)質(zhì)控品——陽性標(biāo)準(zhǔn)品——逐個(gè)分析（標(biāo)出陽性標(biāo)本和可疑標(biāo)本）——調(diào)整參數(shù)，獲得較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示定量結(jié)果——登記，發(fā)報(bào)告。 將所有曲線選中進(jìn)行整體觀察①觀察是否存在污染情況（包括標(biāo)本污染和試劑污染），特別應(yīng)注意大量曲線在同一Ct值出現(xiàn)上漲的情況。②觀察是否有光路傳導(dǎo)阻滯或電壓波動(dòng)等機(jī)器原因形成的異常曲線?？瞻讓?duì)照：僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管作用：監(jiān)測擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染陰性對(duì)照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陰性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室和前處理過程中是否存在污染。陽性對(duì)照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陽性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，避免假陰性的出現(xiàn)。陽性室內(nèi)質(zhì)控品：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知濃度的陽性室內(nèi)質(zhì)控血清。作用：用以監(jiān)控日常實(shí)驗(yàn)的精密度。，若各梯度曲線均未分開，則表明陽模稀釋可能存在問題，提示實(shí)驗(yàn)中存在較大人為誤差。有兩種情況：①若出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而各曲線Ct 值均后移，則判斷是否為試劑擴(kuò)增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。②出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標(biāo)準(zhǔn)品的降解情況。，用作以下三方面監(jiān)控：1)是否存在操作誤差，如加樣量過少等原因?qū)е?03標(biāo)準(zhǔn)品未能檢出；2)是否存在稀釋后的梯度放置過久，低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品降解的情況；3)是若高拷貝標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)Ct值后移，且能排除情況①、②則判斷是否為試劑靈敏度下降。逐個(gè)分析每條曲線，判斷曲線的陰陽性或?qū)倏梢汕€。（可疑標(biāo)本是指曲線在27個(gè)循環(huán)后Ct值出現(xiàn)上漲且平臺(tái)趨勢不明顯或上漲幅度比較低的標(biāo)本?？梢蓸?biāo)本要第二天重做，兩次結(jié)果一致則報(bào)陽性，否則結(jié)果報(bào)陰性。）調(diào)節(jié)基線和閾值以得到較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。電腦據(jù)此曲線給出陽性結(jié)果值。此時(shí)應(yīng)排除某些陰性標(biāo)本因熒光曲線假性上揚(yáng)而得出的假陽性結(jié)果和某些弱陽性標(biāo)本因終末熒光值過低而顯示的假陰性。：及時(shí)登記檢測結(jié)果記錄，發(fā)放臨床報(bào)告。：每次實(shí)驗(yàn)要設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照、一個(gè)陽性對(duì)照、一個(gè)室內(nèi)質(zhì)控血清、一組陽性標(biāo)準(zhǔn)品（4個(gè)梯度101010104）。 。，實(shí)驗(yàn)失控的具體標(biāo)準(zhǔn)詳見《室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序》。出現(xiàn)上述四種情況中的任何一種或多種，當(dāng)日實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可發(fā)報(bào)告，查找原因，重做實(shí)驗(yàn)，并做好記錄。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)，陽性對(duì)照擴(kuò)增增長。，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)三個(gè)參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。，具體標(biāo)準(zhǔn)詳見《室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序》。以上幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均達(dá)到要求后，當(dāng)日實(shí)驗(yàn)有效，可以發(fā)放檢驗(yàn)報(bào)告。7. 結(jié)果失控情況處理及原因分析如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)違背了控制規(guī)則，操作員應(yīng)填寫失控記錄或失控報(bào)告單，上交專業(yè)室主管，由專業(yè)主管做出是否發(fā)出與失控質(zhì)控品相關(guān)的那批患者標(biāo)本檢測報(bào)告的決定。失控信號(hào)的出現(xiàn)受多種原因的影響，這些原因包括：操作上的失誤、儀器維護(hù)不良以及采用的質(zhì)控規(guī)則、控制限范圍、一次測定的質(zhì)控標(biāo)本數(shù)不當(dāng)?shù)鹊取ＪЭ匦盘?hào)一旦出現(xiàn)就意味著與失控質(zhì)控品相關(guān)的那批患者標(biāo)本報(bào)告可能作廢。此時(shí)，首先要盡量查明引起失控的原因，如假失控，可由權(quán)威人士決定、簽字后發(fā)出報(bào)告。如是真失控，最好是糾正原因后，全部標(biāo)本重做，質(zhì)控品測定合格后再簽發(fā)字發(fā)出。當(dāng)?shù)玫绞Э匦盘?hào)時(shí)，考慮采用如下步驟去尋找原因：1)立即重測定同一質(zhì)控品 此步驟是用以查明是否為人誤差或偶然誤差，如是偶然誤差，則重測的結(jié)果應(yīng)在允許范圍內(nèi)(在控)。如果重測結(jié)果仍不在允許范圍，應(yīng)進(jìn)行下一步操作。2)打開一 瓶新質(zhì)控品，重測失控項(xiàng)目 如果新開的質(zhì)控血清結(jié)果正常，那麼原因的質(zhì)控血清可能過期或在室溫放置時(shí)間過長而變質(zhì)，或被污染。如果結(jié)果仍不在允許范圍，則進(jìn)行下一步驟。3)檢查儀器狀態(tài)、清潔擴(kuò)增槽。如不行，進(jìn)行下一步。4)檢查試劑 此時(shí)可更換試劑以查明原因，如不是試劑問題，進(jìn)行下一步。5)請(qǐng)專家或公司工程師幫助 如前面四步都未能得到在控結(jié)果，可能是儀器出現(xiàn)了較大故障，應(yīng)同儀器廠家聯(lián)系請(qǐng)求他們的技術(shù)支援。檢測結(jié)果報(bào)告程序1. 目的：為使報(bào)告的生成、發(fā)放、管理受控，特制訂本程序，確保檢測報(bào)告的準(zhǔn)確、清晰。2. 適用范圍：本程序適用于本基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室所有臨床檢測項(xiàng)目的結(jié)果報(bào)告。3. 職責(zé)：只有經(jīng)PCR培訓(xùn)并獲得上崗證的工作人員才有權(quán)審核和簽發(fā)報(bào)告單。4. 工作程序： 檢測結(jié)果的報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確、客觀和及時(shí)，杜絕虛假報(bào)告。 實(shí)時(shí)熒光PCR測定的數(shù)據(jù)要經(jīng)分析，避免因非特異性熒光而造成假陽性結(jié)果。根據(jù)質(zhì)控品判斷PCR擴(kuò)增的有效性，只有當(dāng)質(zhì)控品的擴(kuò)增結(jié)果符合項(xiàng)目SOP有關(guān)條件時(shí)，才可發(fā)出報(bào)告，否則應(yīng)重新測定。 定性測定的檢測項(xiàng)目其結(jié)果以 “陰性”或“陽性” 報(bào)告；定量測定的，結(jié)果報(bào)告以每毫升拷貝數(shù)（拷貝/ml），如結(jié)果高于測定方法線性范圍上限，則對(duì)樣本稀釋后再測，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測定范圍下限，則報(bào)告多少即可，不能報(bào)告為“0”或“陰性”?！皺z驗(yàn)管理系統(tǒng)”，由電腦管理病人資料。報(bào)告內(nèi)容至少應(yīng)包括：病人姓名、性別、年齡、及測定項(xiàng)目、結(jié)果、參考范圍以及樣本號(hào)、標(biāo)本類型、檢測日期、實(shí)驗(yàn)操作者和審核者的簽名、報(bào)告日期等。否則視為無效或虛假報(bào)告單。門診病人報(bào)告單送至服務(wù)臺(tái)門診報(bào)告發(fā)放處，病區(qū)報(bào)告單由專人送至各病區(qū)。 當(dāng)臨床科室要求電話報(bào)告結(jié)果時(shí)，應(yīng)先確認(rèn)對(duì)方身份，核對(duì)其所查詢的病人姓名、病區(qū)床號(hào)等情況，方可報(bào)告，并明確告知對(duì)方，實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果以檢測報(bào)告單為準(zhǔn)。 當(dāng)患者要求電話報(bào)告結(jié)果時(shí)，應(yīng)讓患者提供病人ID后方告知檢測結(jié)果，并明確告知對(duì)方，實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果以檢測報(bào)告單為準(zhǔn)；當(dāng)需郵寄報(bào)告時(shí)，應(yīng)由患者填寫地址及郵政編碼等，并作記錄。 實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)為患者的檢測結(jié)果保密，不得提供給非相關(guān)人員（查詢或復(fù)?。?. 引用的表格：檢測報(bào)告單格式：附圖04附表19：PCR實(shí)驗(yàn)室遲發(fā)報(bào)告通知單室 內(nèi) 質(zhì) 控 標(biāo) 準(zhǔn) 操 作 程 序 控制實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、精密度，并檢測其準(zhǔn)確度的改變，提高本室常規(guī)工作中的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測的一致性。2. 適用范圍 本程序適用臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量負(fù)責(zé)人和檢驗(yàn)人員對(duì)DNA和RNA分析的室內(nèi)質(zhì)量控制。 3．制定依據(jù) 《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)》申子瑜　李金明　主編　人民衛(wèi)生出版社　2002年第一版 4. 職責(zé) 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量負(fù)責(zé)人和檢驗(yàn)人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的執(zhí)行。評(píng)估檢測結(jié)果正確與否，判定當(dāng)日結(jié)果是否可以被采用。操作步驟a)質(zhì)控品的來源：衛(wèi)生部臨檢中心或試劑盒內(nèi)質(zhì)控品。b)質(zhì)控品與樣本同時(shí)處理，排列順序?yàn)椋簶?biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，臨床樣本。c)質(zhì)控品的處理及分析判斷。d)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷：實(shí)驗(yàn)結(jié)果合格，即發(fā)報(bào)告；實(shí)驗(yàn)結(jié)果不合格，報(bào)告室主任，會(huì)同有關(guān)人員，查找原因，妥善解決。e) 記錄每次檢測質(zhì)控結(jié)果。f) 記錄失控原因及糾正措施。：①描點(diǎn)：a）圖中X線為靶線，X177。2s為警告線，X177。3s為失控線。對(duì)于同一批號(hào)的質(zhì)控血清不論使用幾個(gè)月，其空?qǐng)D均不變化。只要將圖紙上方“起止日期”項(xiàng)填入每個(gè)月的實(shí)際起止日期即可。b）每天將該批號(hào)質(zhì)控血清按有關(guān)規(guī)定程序復(fù)融隨同病人的標(biāo)本同時(shí)檢測。將日期、檢測結(jié)果和操作者如實(shí)記錄在圖下方的相應(yīng)位置，并按前面的方法畫出圖上的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，用直線將該點(diǎn)與前一天的點(diǎn)連接。c）月底計(jì)算當(dāng)月全部質(zhì)控血清檢測結(jié)果的X、s和CV，并進(jìn)行圖形分析和小結(jié)，將質(zhì)量控制圖存入質(zhì)控資料檔案。②圖形分析a）如果在X177。3s線以外，則為失控，應(yīng)立即報(bào)告有關(guān)負(fù)責(zé)人，迅速查找原因。必要時(shí)復(fù)測標(biāo)本，然后方可發(fā)出報(bào)告，并將失控情況、查找過程及處理結(jié)果等詳細(xì)記錄。b）如果在X177。2s線以外，或出現(xiàn)連續(xù)6點(diǎn)以上在一側(cè)等規(guī)律變化，均應(yīng)立即向有關(guān)負(fù)責(zé)人反映，并積極查找原因。但當(dāng)天的檢驗(yàn)結(jié)果一般可以發(fā)出。③通過觀察圖形的規(guī)律性變化進(jìn)行誤差分析，消除誤差來源a）曲線漂移：提示有系統(tǒng)誤差，準(zhǔn)確度發(fā)生了一次性的向上或向下改變。這種變化往往是由于一個(gè)新的情況引起的。如更換不同批號(hào)試劑，啟用新批號(hào)的質(zhì)控血清、操作人員的變換等。在找原因時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)注意“漂移”前后發(fā)生了那些變動(dòng)的因素。b）趨勢性變化：向下或向上的趨勢性變化表明檢測的準(zhǔn)確度發(fā)生了漸漸地變化。這種變化往往是由于一個(gè)逐漸改變的因素造成的。如質(zhì)控血清的降解，試劑效價(jià)的降低等。c)連續(xù)多點(diǎn)分布在靶值一側(cè)：目前，一般認(rèn)為質(zhì)控血清的檢測結(jié)果連續(xù)6天以上出現(xiàn)在靶值同一側(cè)，則應(yīng)迅速查找原因，爭取盡快使之回復(fù)圍繞在靶值隨機(jī)分布的狀態(tài)。因?yàn)榘凑战y(tǒng)計(jì)學(xué)原理，由純隨機(jī)誤差造成的這種情況的可能性很小。％。因此凡出現(xiàn)連續(xù)6天以上出現(xiàn)在靶值同一側(cè)者均有可能存在非隨機(jī)誤差因素。如結(jié)果與靶值偏離并不太大，不會(huì)給臨床使用帶來太大影響時(shí)，一般化驗(yàn)報(bào)告可以照常填發(fā)。d)其他規(guī)律變化：（周期性等），消除誤差來源a)每個(gè)月的月底將該月的全部質(zhì)控血清檢測結(jié)果的X和s與該批測定的X和s 進(jìn)行比較。如果X發(fā)生了變化，說明準(zhǔn)確度發(fā)生了變化提示有非隨機(jī)誤差存在。如果當(dāng)月s不同側(cè)表明檢測的精密度發(fā)生了變化。b)將使用同一批號(hào)質(zhì)控血清的CT值的X和s按月份列出。如果X逐在月上升，應(yīng)考慮保存不當(dāng)造成的試劑效價(jià)降低或質(zhì)控血清本身出現(xiàn)降解。如果各月份X基本一致而s逐月加大，則主要提示常規(guī)工作的精密度下降，應(yīng)重點(diǎn)從操作、管理上找原因。：當(dāng)陽性對(duì)照呈假陰性或陰性質(zhì)控呈假陽性時(shí)為失控；當(dāng)陽性標(biāo)本呈假陰性或陰性標(biāo)本呈假陽性時(shí)為失控。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不合格，報(bào)告室主任，會(huì)同有關(guān)人員，查找原因，妥善解決，并將失控情況、查找過程及處理結(jié)果等詳細(xì)記錄。：、B為假陽性時(shí)，則應(yīng)考慮為：；b. 擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”。可作以下實(shí)驗(yàn)鑒定：取4個(gè)空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)60分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，如為陽性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合物的管為陰性，即可排除試劑污染的可能，表示實(shí)驗(yàn)室有擴(kuò)增產(chǎn)物“污染”。此時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，然后先暫時(shí)停止PCR實(shí)驗(yàn)，采取各種有效的消毒清潔工作直至產(chǎn)物污染徹底消失后才可進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。如果有試劑污染時(shí)，應(yīng)更換另一批號(hào)的試劑進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，待重復(fù)實(shí)驗(yàn)陰性質(zhì)控品無失控后，方可報(bào)告結(jié)果。，則應(yīng)判斷為實(shí)驗(yàn)操作過程中所致的標(biāo)本間的交叉“污染”，出現(xiàn)這種情況很大程度上屬于偶然誤差，具體地說，如強(qiáng)陽性的標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染，強(qiáng)陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用的離心管核酸提取時(shí)在較高溫度溫育時(shí)蓋子崩開。因此在PCR實(shí)驗(yàn)前離心管、濾心吸頭的質(zhì)檢以及在實(shí)驗(yàn)中一發(fā)現(xiàn)手套可能有污染就立即更換手套顯得尤為重要，并且PCR實(shí)驗(yàn)人員的嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的工作態(tài)度是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。：：：可更換新的臨界對(duì)照品，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果對(duì)照品無失控則表示上次實(shí)驗(yàn)的臨界對(duì)照品已失效，不能再用于實(shí)驗(yàn)。如果還有失控現(xiàn)象，則應(yīng)考慮：b. 核酸提取過程中的隨機(jī)誤差：如核酸性對(duì)照失控。如核酸提取中的丟失、裂解溫度不夠、裂解不充分、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。應(yīng)重新嚴(yán)格核查該過程中的各步驟是否出錯(cuò)，然后重新操作一遍，臨界對(duì)照品無失控現(xiàn)象后才報(bào)告結(jié)果。如果仍失控，則考慮：儀器問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致