艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法(編輯修改稿)
2025-06-22 18:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 除病毒 DNA鏈末端的核苷類似物 Thymidine analogues mutations: 突變引起ATP或者焦磷酸介導(dǎo)的切除 DNA鏈 3?末端核苷類似物。 核苷和核苷類似物 耐藥機(jī)制： 非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 (NNRTI) 突變降低了抑制劑對酶的結(jié)合力。不同于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其單一突變就能導(dǎo)致高度耐藥。如 K103N、 Y181C。 耐藥機(jī)制： K103N突變的機(jī)制 耐藥機(jī)制： 蛋白酶抑制劑 HIV蛋白酶由兩個同樣的蛋白質(zhì)鏈組成。這兩個蛋白質(zhì)鏈在一起就如同核桃的兩半，而蛋白酶的活性位點就在兩個半殼的中間。 突變點的表示方法： 基因的突變通常以字母－數(shù)字－字母的書寫方式來表示，第一個字母代表野生型病毒株特定密碼子處的氨基酸，第二個字母代表在特定密碼子處替換了的氨基酸，中間數(shù)字表示突變點的位置。例如：逆轉(zhuǎn)錄酶（ RT） K103N的突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第 103位密碼子的氨基酸由天冬酰胺（ K）變成為賴氨酸（ N）。 如何檢測耐藥株： 目前耐藥性檢測有兩種方法，即 表型檢測及基因型檢測 。表型檢測通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進(jìn)行，而基因型檢測則通過分子生物學(xué)方法檢測與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變?；蛐蜋z測的費用較低，技術(shù)也相對容易，可在樣品收集后 1～ 2周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關(guān)知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結(jié)果進(jìn)行正確的分析。表型檢測可以直接檢測病毒的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測。 如何檢測耐藥株： Translation into linear string of amino acids Folding into functional protein HIV RNA 表型檢測 基因型檢測 基因型和表型檢測 檢測中注意事項 : — 在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保 證耐藥株占總病毒量的 20%以上； — 病毒載量 1000時 , 可出現(xiàn)假陰性。 我國 HIV耐藥性本底抽樣調(diào)查結(jié)果 1)對于 RT基因區(qū)共完成對 21個省區(qū)共 143個樣本的測序 ，僅有 2例發(fā)現(xiàn)具有輕微耐藥 （ 占總樣本數(shù)的 %） 2)對于蛋白酶基因區(qū)本次調(diào)查共完成 20個省區(qū) 168個樣本的分析 ， 僅發(fā)現(xiàn)有 2例樣本 （ 占總樣本數(shù) %） 具有輕微耐藥 。 結(jié)論：當(dāng)前我國 HIV耐藥性處于較低狀態(tài) ， 對于幾乎所有藥物敏感 ， 我國抗 HIV藥物的使用如果有計劃的開展 ，應(yīng)當(dāng)會有較好的效果 ， 但應(yīng)加強(qiáng)治療依從性促進(jìn)工作和耐藥毒株的監(jiān)測工作 。 HIV基因型耐藥性檢測 （序列測定法） 檢 測 流 程 病人血漿標(biāo)本 HIV RNA 病毒 cDNA HIV RT和 PR基因片段 序列測定 結(jié)果解釋 RNA提取 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增 特定的解釋系統(tǒng) 標(biāo)本 新鮮 EDTA抗凝血漿，或 80℃ 保存，避免反復(fù)凍融 病毒 RNA提?。? Qiagen公司試劑盒 ） 裂解標(biāo)本，滅活 RNA酶 加到離心柱中， RNA與硅膠膜結(jié)合 洗兩次，去除雜質(zhì) 用無 RNA酶的緩沖液洗脫 RNA 收集 RNA備用 優(yōu)點：操作簡便、快速、得率高 逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 反應(yīng)體系： 10XBuffer 1?l dNTP ?l 外側(cè)反向引物 1?l RNase inhibitor ?l MMuLV RT ?l DEPC水 2?l RNA模板 5?l 42℃ 水浴 1小時， 95℃ 5 分鐘滅活 RT 巢式 PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系 ： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 外側(cè)正向引物 1?l 外側(cè)反向引物 1?l Taq酶 ?l 水 ?l cDNA模板 10?l 94℃ 5min， 94℃ 30sec， 55℃ 30
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