臨檢培訓基因擴增技術在遺傳病基因診斷中的應用臨檢培訓班(編輯修改稿)
2025-06-22 01:50 本頁面
【文章內容簡介】 PCR/RFLP PCR/SSCP PCR/ASO(Allilespecific oligoprobe) PCR/sequencing ASA(Allilespecific Amplification) mPCR(multiplex PCR) FQPCR(RealTime PCR) 血友病甲基因診斷 劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白， 朱章菱，周艷，劉亮，張晶 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院 北京基因診斷實驗室 北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所 甲型血友病 Ⅷ 因子基因倒位的研究及檢測新技術： 血友病甲（ HA）是常見的 X連鎖遺傳性出血性疾病，是由于凝血因子 Ⅷ （ FⅧ ）基因缺陷所致。約半數(shù)重型HA的患者，是由于 FⅧ 基因第 22內含子（ IVS22）發(fā)生基因倒位所致。迄今，國際上檢測這種基因倒位都是用Southern印跡雜交技術。雖然這種技術能夠準確的查出這種基因倒位，但操作步驟多，流程長，出結果慢，難度大，需要 DNA樣品量大以及操作放射性同位素標記的探針等。我們從 1996年開始在國際上率先研究利用長距離DNA擴增技術（ LDPCR），替代 Southern雜交進行 FⅧ 基因倒位的診斷。經過近二年的努力終獲成功，并進行了推廣應用。主要完成了以下幾方面工作 ： 自行設計合成了長距離 PCR的四個引物 P、 Q、 A、 B。預期擴增產物長度 P/Q為 12Kb， A/B為 10Kb， P/B及 A/Q為11Kb。 四引物及三引物 LDPCR體系的比較 系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量， deazadGTP的比例，DMSO濃度，基因組 DNA的質量和用量，退火及延伸溫度、時間，低濃度瓊脂糖凝膠電泳條件及操作方法等。使 1012Kb DNA擴增及檢測倒位終獲成功。這充分體現(xiàn)了該成果的科學性和先進性 不同量模板 DNA對 LDPCR 的影響 15號的 DNA量分別為 ， ， ， ， 不同量 deazadNTP對 LDPCR的影響 15號 dNTP濃度分別為 200， 300， 400， 500， 600μM 53份重型 HA患者及家系成員 DNA標本，分別用經典的 Southern印跡雜交和本 LDPCR技術在雙盲條件下進行FⅧ 基因倒位檢測。兩者得出的診斷結論完全一致。表明用 LDPCR技術診斷該基因倒位，檢出攜帶者的特異性和靈敏度均達到百分之百。而且具有操作步驟較簡便，需DNA量少，出結果快，不需操作放射性同位素標記探針，在無法取得先癥者患兒血樣的情況下，也可直接查攜帶者是否攜帶倒位基因，如果是可直接做產前診斷等優(yōu)點。 雙盲實驗（ 53份 DNA）結果證明： LDPCR可獨立用于重型 HA基因倒位的檢測 編 號 帶 型L D P C R 診斷結果3,4,5,9,10,14, 16,17,25, 27,28,30,3 2,36,37,39,42,44,4 9,51,53,5 5,571 1Kb 倒位者2,6, 8,1 1,12 ,15, 20, 23,2 4,26 , 29,3 1,33 , 35,38,40,41,43,4 5,46,47,4 8,50,52,56 ,59,6012Kb 野生型1,54,5812Kb1 1Kb攜帶者應用實驗成功的 LDPCR技術，對來自北京、天津、江蘇、湖北、廣西、四川、山東、福建等省市的 108 個重型 HA患者及數(shù)目不等的家系成員進行了檢測，共查出 FⅧ 基因倒位 47例，占 44%，與國際上用 Southern雜交技術查出的基因倒位引起的 HA約占重型 HA的 4050%一致。另外，檢出30余位倒位基因攜帶者，為將來開展產前基因診斷，杜絕新的 HA患兒出生打下了基礎，對優(yōu)生、提高人口素質有重要意義。 14個 DNA標本 LDPCR電泳結果 M： λDNA/HindⅢ 酶解產物，三條帶分別為， ， 美國 方法的摘要文章。但我們較他們有兩個顯著不同特點：一是我們強調了運用 P、 Q和 B這三個引物就完全可以滿足診斷的需要，省去一個引物 A，減少一條 10Kb擴增帶。這條10Kb帶是多余的，且使 11Kb及 12Kb帶出現(xiàn)的難度增大。二是我們研究成功方法后，立即迅速應用于患者及其家系的診斷和攜帶者檢出，現(xiàn)已達一百余家系，產生了很大社會效益和一定的經濟效益，并開始向兄弟單位推廣應用。 HA8家系 PCR/BclⅠ 酶解分析結果 M: pBR322/MspⅠ ； 0:Ⅱ 2（酶解前）擴增帶長374bp，圖中 211bp和 163bp為酶解后產物
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