【文章內(nèi)容簡介】 胞內(nèi)核酸酶的降解，所以可直接轉(zhuǎn)化外源 DNA。 ? （ 8） 花粉管通道轉(zhuǎn)化法 此方法只用于植物。植物授粉過程中，將外源 DNA涂在柱頭上，使 DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細胞壁的卵、合子及早期的胚胎細胞。 ? （ 9） 精子介導法 精子介導的基因轉(zhuǎn)移是指精子同外源 DNA共浴后再給卵子受精，使外源 DNA通過受精過程進入受精卵并整合于受體的基因組中。 ? （ 10） 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法的依據(jù)是有的動物細胞能捕獲黏附在細胞表面的 DNA磷酸鈣沉淀物，使 DNA轉(zhuǎn)入細胞。 ? 基本操作過程： ? ①將待轉(zhuǎn)染的外源 DNA同 CaCl2混合制成 CaCl2DNA溶液，逐滴加入到不斷攪拌的 Hepers磷酸鈣溶液中，形成 DNA磷酸鈣共沉淀復合物； ? ②然后用吸管將沉淀復合物黏附在哺乳動物單層培養(yǎng)細胞的表面上； ? ③保溫幾小時后，用新鮮培養(yǎng)液洗凈細胞，再用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至外源基因表達。 ? 病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導法 ? 用病毒（噬菌體） DNA（或 RTDNA）構(gòu)建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆載體，在體外包裝成病毒（噬菌體）顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶的重組 DNA進入受體細胞。 重組子的篩選 ? 目前已經(jīng)發(fā)展和應用了一系列構(gòu)思巧妙，可靠性較高的重組體克隆檢測法，包括使用特異性探針的核酸雜交法，免疫化學法，遺傳檢測法和物理檢測法等。 ? 根據(jù)載體分子表型特征選擇生組體分 ? ⑴抗藥性標記插入失活選擇法 ? 克隆子的篩選 ? 根據(jù)載體選擇標記基因篩選轉(zhuǎn)化子 ? (1)根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子 ? (2)根據(jù)載體除草劑抗性基因和相應的選擇藥物篩選轉(zhuǎn)化子 ? 由于植物細胞對多數(shù)抗生素不敏感 ,所以常用抗除草劑的蕾作為選擇標記基因 . 基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶 (PAT),使轉(zhuǎn)化子對含有磷化麥黃酮 (PPT)成分的除草劑具有抗性 . ? (3)根據(jù) lacZ′基因互補顯色篩選轉(zhuǎn)化子 ? (4)根據(jù)生長調(diào)節(jié)劑非依賴型篩選轉(zhuǎn)化子 ? 這類選擇標記基因產(chǎn)物是激素合成必需的酶類 ,離體培養(yǎng)不含這類選擇基因的細胞時 ,必須添加外源激素 ,而含有這類選擇標記基因的轉(zhuǎn)化子能合成激素 ,變?yōu)榧に刈责B(yǎng)型 .因此在培養(yǎng)基中不添加外源激素的情況下 ,只有轉(zhuǎn)化子才能生長 .此類選擇標記基因常用于篩選植物轉(zhuǎn)化子 .這樣的基因如色氨酸單加氧酶基因(iaaM)和吲哚乙酢胺水解酶基因 (iaaH),其表達產(chǎn)物可將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚乙酸 . ? (5)根據(jù)核苷酸合成代謝相關酶基因的缺失互補篩選轉(zhuǎn)化子 ? 胸腺核苷激酶基因 (tk).二氫葉酸還原酶基因 (dhfr),及次黃呤一鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因 (hgprt),等的表達產(chǎn)物直接參與核苷酸合成代謝 .這些基因缺失的缺陷型細胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡 ,只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長 .如果用這樣的缺陷型細胞作為受體細胞 ,導入含有這些基因的外源 DNA,補充原來缺失的基因 ,使核苷酸合成代謝恢復正常 ,可以在不添核苷酸的培養(yǎng)基中正常生長 .根據(jù)這一性質(zhì)可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化子 .此方法主要用于篩選動物轉(zhuǎn)化子 . ? 根據(jù)報告基因篩選轉(zhuǎn)化子 ? 作為報告基因 ,其表達產(chǎn)物應是便于檢測 ,定量和靈敏度高的基因 . ? (1) β葡醛糖酸酶基因 (gus) ? (2)螢火蟲熒光素酶基因 (luc) ? gus表達產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶 (LUC)在 Mg2+的作用下 ,可以與熒光素和 ATP底物發(fā)生反應 ,形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素?；瘡秃衔?,經(jīng)過氧化脫羧作用后 ,該復合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素 ,可以用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產(chǎn)生的熒光 ,是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報告基因 . ? (3)綠色熒光蛋白基因 (gfp) ? 當綠色熒光蛋白暴露于 395nm波長的燈光下 ,便會被激發(fā)出綠色熒光 ,因此可作為報告基因 .水母綠色熒光蛋白基因已廣泛地用于篩選動植物的轉(zhuǎn)化子 . ? 根據(jù)形成噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子 ? 重組子的鑒定 ? 根據(jù)重組 DNA分子特征鑒定重組子 . ? 根據(jù)重組 DNA分子大小鑒定重組子 ? 根據(jù)重組 DNA分子限制性內(nèi)切核酸酶酶切圖譜鑒定重組子 ? 根據(jù) PCR擴增片段鑒定重組子 ? 采用 DNA雜交法鑒定重組子 ? 應用 DNA芯片鑒定重組子 ? 根據(jù) DNA核苷酸序列鑒定重組子 TTCCACTGGA CATAAATCCC CCAAGATTCA TACTTATAAA TACCCTTGAA AAGAACCAAA GAACCATCCA TCAAGAATGA AGATTACAGG CTATAAATAC ATAGACATCA TGATCCAACT ATCCCCATTG TTGCTACTCC CATTATTCTC AGTATTCAAC TCCATTGCTG ATGCTTCAAC TGAATACCTT AGACCTCAAA TCCATTTAAC CCCAGATCAA GGTTGGATGA ATGATCCGAA TGGGATGTTT TATGATAGGA AAGACAAGTT ATGGCATGTT TATTTCCAAC ATAATCCAGA TAAGAAATCA ATTTGGGCTA CACCTGTCAC TTGGGGTCAT TCCACTTCAA AAGATTTATT AACTTGGGAT TATCACGGTA ATGCATTAGA ACCTGAAAAT GATGATGAAG GTATCTTTTC ? ? 根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (mRNA)鑒定重組子 . ? 根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物 (蛋白質(zhì)、酶、多肽 )鑒定 ? 蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定重組子 ? 重組子由于含有外源基因 ,如果能夠正確表達 ,在總的表達產(chǎn)物中增加了外源基因表達的多肽 (蛋白質(zhì) ),所以從重組子中提取的總蛋白質(zhì)進行凝膠電泳時 ,電泳圖譜上會出現(xiàn)新的蛋白帶 ,根據(jù)這一現(xiàn)象就可以初步鑒定是重組子 . ? 免疫檢測法鑒定重組子 ? (1)酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) ? (2)Westhern印跡法 ? (3)免疫沉淀測定法 (immunoprecipitation test) ? (4) 固相放射性免疫測定 (RIA)法 細胞工程 ? 31 細胞工程基本介紹。 細胞工程細胞工程（ cell engineering）是指應用現(xiàn)代細胞生物學、發(fā)育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法，按照人們的需要和設計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和 細胞培養(yǎng) 等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。 ? 細胞工程的基本操作 (三大技術(shù)即 無菌操作技術(shù) ,細胞培養(yǎng)技術(shù) ,細胞融合技術(shù) )。 1 無菌操作技術(shù) ：就是細胞工程的所有實驗卻要求無菌條件下進行。 ? ⑴對人消毒。 ? ⑵對實驗室內(nèi)一切用品消毒。 ? ⑶對周圍環(huán)境保持清潔。 ? 2，細胞培養(yǎng)技術(shù) ：是指 動植物 和 微生物細胞 在體外無菌條件下的保存和生長。 ? 該技術(shù)的主要流程是： ? ⑴取材和除菌。 ? ⑵細胞培養(yǎng)基的配制（配制 —— 滅菌 —— 接種）。 ? ⑶最佳條件下進行培養(yǎng)（溫度，濕度，光照，氧氣， CO2）收獲或傳代。 ? 3，細胞融合技術(shù) ： 就是兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生分子重排，導致細胞合并，染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程。 ? 細胞融合的技術(shù)流程： ? ⑴原生質(zhì)體的制備 （對微生物或植物細胞去除胞壁）。 ? ⑵誘導細胞融合 〈 常田聚乙二醇（ PEG）或電激方法進行細胞融合。 ? ⑶原生質(zhì)體的再生 〈 融合后的細胞涂布在某種特殊培養(yǎng)基上，讓細胞壁再生。 〉 ? ⑷ 雜合細胞的篩選 （把生壁的培養(yǎng)物涂在篩選培養(yǎng)基上，雜合細胞生長，未融合細胞不長。 32 植物細胞工程 ? 一 .植物組織培養(yǎng)定義 ：組織培養(yǎng)是在無菌和人為控制外因（營養(yǎng)成分，光，溫，濕）條件下培養(yǎng)，研究植物組織器官，甚至從中分化，發(fā)育出整體植物的技術(shù)。 ? 植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)就是： ? 植物細胞具全能性 。 ? 植物組織培養(yǎng)流程： ? 〈 1〉 預備階段 ? ①外植體的選擇 〈 大小要適宜，選擇部位要準確，一般是幼嫩組織和器官，如芽尖或根尖 〉 。 ? ②除菌 〈 外植體 自來水多次漂洗 消毒劑處理 無菌水反復沖洗 無菌濾低吸干 〉 (動畫 ) ? ③ 適宜培養(yǎng)基的配制。 ? 〈 2〉 去分化階段的誘導 。 ? 外植體是已分化成各種器的切段，故必讓這些器官去分化，使各細胞重新處于旺盛有絲分裂的分生狀態(tài)，一般在培養(yǎng)基中添加較高濃度的生長素類激素。 ? 〈 3〉 繼代增殖： 愈傷組織長出后經(jīng) 46周的細胞迅速分裂，原有培養(yǎng)基中的水分及營養(yǎng)成分已被耗光，有害代謝物積蓄，必須進行移植，繼代。 ? 〈 4〉 生根成芽 ：愈傷組織只有經(jīng)過就分化才能形成胚狀體，繼而長成小植株 .胚狀指的是在組織培養(yǎng)中分化產(chǎn)生的具有芽端和根端類似合子胚的構(gòu)造，通常要將愈傷組織移置于合適是細胞分裂類和生長類的分化培養(yǎng)基中，才能誘導胚狀體的生成。光照是本階段的必備外因。 ? 〈 5〉 移栽成活 ：把長在 人工照明玻璃瓶內(nèi)的小苗移室外以利于生長 〈 此時保證適度的光溫，濕度條件 〉 。 ? 動畫原理 ? 二 植物細胞培養(yǎng) 〈 懸浮細胞培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng) 〉和次生代謝物的生產(chǎn)。 ? 植物次生代謝物（ plant secondary metabolites）是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物 .植物次生代謝物種類繁多，化學結(jié)構(gòu)迥異。現(xiàn)在，已知大約有 10， 000種次生代謝物，包括酚類、黃酮類、香豆素、木脂素、生物堿、糖苷、萜類、甾類、皂苷、多炔類、有機酸等，可分為酚性化合物、萜烯類化合物、含氮有機物三大類。 ? 植物次生代謝物的應用，以醫(yī)藥為例，至今人們依賴于從植物中提取的重要的藥物就有五十多種。隨著“重返大自然”的呼聲日益高漲，人們已認識到：現(xiàn)在是從高等植物的次生代謝產(chǎn)物中去尋找、開發(fā)新藥的時代。 ? 1． 藥用植物次生代謝產(chǎn)物 藥用植物次生代謝產(chǎn)物是 指藥用植物體內(nèi)的一大類化合物，它們是細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常運行的非必需的小分子化合物 ，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期的特異性。 不同藥用植物的次生代謝產(chǎn)物的合成和積累經(jīng)常在不同的部位，薄荷屬植物次生代謝產(chǎn)物積累在油腺等特殊的結(jié)構(gòu)當中，還有青蒿中的青蒿素的合成和儲藏均在腺體特異細胞器中進行。 藥用植物次生代謝物種類繁多，結(jié)構(gòu)迥異。這些次生代謝產(chǎn)物可分為 苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、類萜、甾體及其甙、生物堿 七大類。還有人根據(jù)次 生產(chǎn)物的生源途徑分為 酚類化合物、類萜類化合物、含氮化合物（如生物堿） 等三大類，據(jù)報道每一大類的已知化合物都有數(shù)千種甚至數(shù)萬種以上。 ? 在次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中，藥用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)是通過給予體外生長的植物細胞一定的營養(yǎng)條件，使其生長，并根據(jù)植物或植物不同組織的細胞調(diào)節(jié)生長 條件來獲取所需的次生代謝產(chǎn)物的生物技術(shù)。由于植物體內(nèi)的任何一個細胞都包含有整體植物全部的遺傳信息，在一定條件下具有發(fā)育成一個完整植株的能力，所以 通過細胞培養(yǎng)技術(shù)可得到藥用植物的次生代謝產(chǎn)物。 用藥用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物有很大潛力。 首先次生代謝產(chǎn)物是在完全人工控制的條件下生產(chǎn)的，可一年四季不斷進行，不受地區(qū)和季節(jié)限 制，節(jié)約土地，較便于工業(yè)化生產(chǎn) 。其次， 通過改變培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良系的方法可得到超越原植物產(chǎn)量的代謝物 ，例如通過新疆紫草的細胞培養(yǎng)獲得了比原植株含 量高 6倍的紫草素。再者， 藥用植物的細胞培養(yǎng)是在無菌條件下完成的，因此可排除病菌及蟲害對藥用植物的侵擾。 ? 我們還可以對有效成分的合成路線進行遺傳操作，以提高所需的次生代謝產(chǎn)物含量，也可以進行特定的生物轉(zhuǎn)化反應，大規(guī)模生產(chǎn)我們所需的有效次生代謝 產(chǎn)物。為了探索新的合成路線和獲得新的化合物，可以往組織培養(yǎng)物中加入一種前體，以產(chǎn)生正常情況下原植物所不含的底物，甚至是至今在自然界還沒有的化合 物。如植物組織培養(yǎng)選擇出來的毛花洋地黃品系能使毛地黃毒苷或其 6－甲基衍生物在 C－ 12位置羥基化而轉(zhuǎn)化成地高辛或 6－甲基地高辛，通過這種細胞懸浮培 養(yǎng)物的生物轉(zhuǎn)化，能迅速有效地幾乎全部轉(zhuǎn)化成更有醫(yī)藥價值的強心劑地高辛。 ? 展 ? 到了 90年代，國內(nèi)的藥用植物細