【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 飾來自 Schwanniomyces occidentalis的淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 應(yīng)用于淀粉酒精和低熱量啤酒的生產(chǎn) 葡聚糖酶 應(yīng)用于葡聚糖降解和啤酒過濾澄清 Saccharomyces Cerevisiae 1,4葡聚糖酶基因?qū)肫咸丫平湍钢斜磉_(dá) 增加釀制酒的果香味 萜類化合物形成 （四）應(yīng)用于食品級(jí)酶制劑生產(chǎn)菌的改良 凝乳酶（ chymosin）是第一個(gè)應(yīng)用基因工程技術(shù)把小牛胃中的凝乳酶基因轉(zhuǎn)移至細(xì)菌或真核微生物生產(chǎn)的一種酶。 現(xiàn)將 NovoNordisk、 GistBrocades等公司采用基因工程改良霉菌種列于表 2表 2表 27。 表 25 丹麥 Novo Nordisk公司利用基因工程改良產(chǎn)酶微生物菌種 [12] （ 5）應(yīng)用于生產(chǎn)保健食品的有效成分 ? 現(xiàn)在 ， 可以采用轉(zhuǎn)基因手段 ， 在動(dòng) 、 植物或其細(xì)胞中 ， 得到基因表達(dá)而制造有益于人類健康的保健成分或有效因子 。 采用基因重組構(gòu)建軍一株高表達(dá)的單鏈蛋白 ， 以加速催化生成維生素 C的前體 2KLG， 便可有效地縮短生產(chǎn)維生素 C的生產(chǎn)周期 。 ? 超氧化物歧化酶 （ SOD） 能有效消除氧自由基 ， Brehm等人將BStearothermophilus的 MnSOD基因克隆入大腸桿菌中 ， 其重組體MnSOD在大腸桿菌高效達(dá) ， 產(chǎn)生的 SOD占可溶性蛋白 49%。 采用基因重組技術(shù)克隆破囊壺菌 （ Thraustochy triumroseum） DHA合成關(guān)鍵酶基因 ， 進(jìn)而在酵母真核細(xì)胞中表達(dá) 。 Anammartet[14]克隆了畢氏酵母 △ 9脂肪酸脫飽和酶基因及其調(diào)節(jié)機(jī)制 。 （ 6）應(yīng)用于食品微生物快速檢測(cè) ? 隨著 DNA分子檢測(cè)技術(shù)和 PCR等技術(shù)的應(yīng)用 ， 可使沙門氏菌 、 李斯特氏菌 、 致瀉性 。 二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品 ? 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品是由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的食物或利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為原料生產(chǎn)的食品或食品添加劑 。 1985年 ， 第一例轉(zhuǎn)基因家畜研制成功由于轉(zhuǎn)基因家禽及其生產(chǎn)的食品是人類較直接的食物 ， 基因重組技術(shù)改進(jìn)牛奶成分如表 28所示 。 表 28 基因重組技術(shù)改進(jìn)牛奶成分 [18] 三、轉(zhuǎn)基因植物食品 ? 所謂轉(zhuǎn)基因植物食品是指由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的食物或利用轉(zhuǎn)基因植物為原料生產(chǎn)的食品或食品添加劑 。 1983年 ， 世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物即轉(zhuǎn)抗蟲基因的煙草問世 。 1994年美國(guó) FDA批準(zhǔn)延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄上市 。 ? Ti質(zhì)粒是誘導(dǎo)植物腫瘤的質(zhì)粒 。 依據(jù) T區(qū)攜帶基因功能 ， 可決定植物冠癭瘤的形成和控制冠癭堿的合成 。 Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的可轉(zhuǎn)移 DNA（ TDNA） 復(fù)促進(jìn) Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞 ChDNA中 。 其基因重組和轉(zhuǎn)移過程如圖 215所示 。 圖 215 利用 Ti質(zhì)粒將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入植物組織示意圖 [2] ? 至目前為上 ， 在歐洲根據(jù)相關(guān)法規(guī) （ 90/220EEC） 已有 10多種轉(zhuǎn)基因植物 （ 作物 ） 被批準(zhǔn)上市 ， 如表 29所示 。 在世界上有 23個(gè)作物品系已準(zhǔn)許進(jìn)行種植和飼料使用 ， 延遲成熟番茄 （ 表 210） 以及改變脂肪含量的轉(zhuǎn)基因作物 （ 如表 211） 也已在某些國(guó)家準(zhǔn)予種植 。 表 29 歐洲獲準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品 [18] 表 210 世界各地種植的延遲成熟番茄及其產(chǎn)品 [18] ? 注： MFA—改變脂肪酸含量 （ GmFad21 為 б12去飽和酶基因； BayTE為硫脂酶基因 ， 源自海灣月桂樹 Umbellaria californica） ； ABR—抗抗生素 （ bla為氨芐青霉素耐藥性基因 ， nptⅡ 卡那霉素耐藥性基因 ） ； RP—報(bào)告基因（ gus為 β葡糖醛酸酶基因 ） 。 ? 目前 ， 我國(guó)獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因作物 （ 如表 212） 和已發(fā)放安全證書的進(jìn)口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品見表 213。 表 212 我國(guó)獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因作物 [19] 表 213我國(guó)已發(fā)放安全證書的進(jìn)口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 [19] 四、食品與基因工程產(chǎn)業(yè)化 ? 工程菌皺胃酶應(yīng)用于干酪生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化 ? 干酪是用皺胃酶或胃蛋白酶將原料乳凝聚 ， 然后將凝塊進(jìn)行加工 、 成型或發(fā)酵成熟而制成的富有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的乳制品干酪 （ cheese） 。 （ 一 ） 干酪制造工藝流程 第八節(jié) 后基因組學(xué)及其應(yīng)用研究 一、后基因組學(xué)涵義 ? 所謂后基因組學(xué) （ postgenomics） 是指包括基因組學(xué) （ genomis） 、蛋白質(zhì)組學(xué) （ proteomics） 、 代謝組學(xué) （ metabotomics） 和生物信息學(xué) （ bioinformatics） 等主要內(nèi)容 。 二、后基因組學(xué)的應(yīng)用研究 ? DNA結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān) 。 ? [21][22] ? “ 生物工廠 ” 提供人類優(yōu)質(zhì)食品 課程論文： ? 基因工程與食品 ? 概念清晰 ? 基因工程研究?jī)?nèi)容和作用 ? 基因工程在食品中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)方面。 ? 你對(duì)基因工程的認(rèn)識(shí) 第三章 食品與蛋白質(zhì)工程 ? 第一節(jié) 概述 ? 第二節(jié) 理性分子設(shè)計(jì)和定位突變技術(shù) ? 第三節(jié) 體外定向進(jìn)化 ? 第四節(jié) 融合蛋白技術(shù) ? 第五節(jié) 食物蛋白質(zhì)改性技術(shù) 第一節(jié) 概述 一、蛋白質(zhì)工程的涵義 ? 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能關(guān)系為基礎(chǔ) ， 通過基因修飾 、蛋白質(zhì)修飾等分子設(shè)計(jì) ， 對(duì)現(xiàn)存蛋白質(zhì)加以改造 ， 組建新型蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù) 。 ? 理性設(shè)計(jì)是在蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾改造 ， 但是 ， 產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)確定 、 具有新功能特性蛋白質(zhì)并不容易 ， 無法滿足對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行分子改良的要求 。 二、理性分子設(shè)計(jì)和非理性分子設(shè)計(jì) ? 所謂非理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化就是在不清楚蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制的情況下 ， 在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然進(jìn)化的過程 （ 隨機(jī)突變 、 重組和選擇 ） ，在一定條件下使基因發(fā)生大量變異 ， 然后通過多輪高通量的篩選方法定向選擇出所需要的特性突變物 ， 在較短時(shí)間內(nèi)完成漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過程 ， 得到具有特性預(yù)期的新蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)工程技術(shù) 。 非理性設(shè)計(jì)的主要技術(shù)包括定向進(jìn)化 (directed evolution) 、 DNA 改組 (gene shuffling)及融合蛋白 (fusions of proteins)技術(shù)等 。 三、蛋白質(zhì)工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用 ? 蛋白質(zhì)工程在食品工業(yè)中應(yīng)用主要集中在食品工業(yè)專用酶制劑的改造方面 。 通過酶結(jié)構(gòu)或局部構(gòu)象的調(diào)整和改造 ， 可大大提高食品專用酶制劑的耐高溫 、 抗氧化能力 ， 增加酶的穩(wěn)定性和適用 pH 范圍 ， 從而獲得性質(zhì)更穩(wěn)定 、 作用效率更高的酶 。 第二節(jié) 理性分子設(shè)計(jì)和定位突變技術(shù) 一、蛋白質(zhì)理性分子設(shè)計(jì)的基本步驟 ? 基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理性分子設(shè)計(jì)過程基本分為以下步驟 ， 如圖 31所示 。 ? 表 31列出了蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法 蛋白質(zhì)幾何優(yōu)化 結(jié)構(gòu)比對(duì)分析 天然蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)晶體學(xué) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 突變體設(shè)計(jì)預(yù)測(cè) 合成定位突變 從數(shù)據(jù)庫(kù)輸入 分離純化與表征 新蛋白質(zhì) 圖 31 蛋白質(zhì)理性分子設(shè)計(jì)流程圖 表 31 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法 ? 表 32列出了目前蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)所涉及的計(jì)算工具及軟件 。 表 32 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的技術(shù)工具及網(wǎng)址 二、定位突變 ? 定位突變是在已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上 ， 在已知 DNA序列中取代 、 插入或刪除特定的核苷酸 ， 從而產(chǎn)生具有新性狀的的突變蛋白質(zhì) （ 酶 ） 分子的一種蛋白質(zhì)工程技術(shù) ， 表 33列出了部分應(yīng)用定位突變技術(shù)取得成效的工業(yè)酶制劑 。 表 33 部分應(yīng)用定位突變技術(shù)取得成效的工業(yè)酶制劑 ? （ 一 ） 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變的原理是用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物 ，在聚合酶的作用下啟動(dòng) DNA 分子進(jìn)行復(fù)制 。 主要的過程見圖 32)：詳細(xì)步驟： 圖 32 寡核苷酸介導(dǎo)的定位突變方法 ? （ 二 ） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR ）介導(dǎo)的定位突變法 ， 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR ） 介導(dǎo)的定位突變法是重組 PCR (rebinment PCR)的一種 ， 見圖 33 。 ? PCR 介導(dǎo)的定位突變法優(yōu)點(diǎn)是操作較簡(jiǎn)單 ， 突變的成功率可達(dá)100%。 ? （ 三 ） 盒式突變 ， 盒式突變（ cassette mutagenesis） 也稱片段 取 代 法 （ DNA fragment replacement） ， 是一種區(qū)域性定位突變方法 。 圖 33 PCR介導(dǎo)的定位突變方法 三、定位突變技術(shù)在酶結(jié)構(gòu)改造中的應(yīng)用 ? （ 一 ） 淀粉酶 ， 通過定位突變技術(shù)得到了一種 α淀粉酶的雙突變體A209V/H133T， 該突變酶在 90℃ 時(shí)的半衰期比正常酶增加了 9 倍 。 ? （ 二 ） 蛋白酶 ， 在枯草桿菌蛋白酶的活性位點(diǎn)內(nèi)有一個(gè) Met 殘基 ， 利用定位誘變用 Cys 代替 Met 可以增加枯草桿菌蛋白酶的活性 。 ? （ 三 ） 脂肪酶 ， Yamaguchi 等采用定位突變將 Cys 二硫鍵引入 Humicola lanuginsa 脂肪酶 ， 使突變體的熱穩(wěn)定性提高了 12℃ ， 酶的最適溫度提高了10℃ 。 Kampen 等研究了 Staphylococcus hyicus 脂肪酶的突變體對(duì)底物專一性的影響 ， 發(fā)現(xiàn)將 356 位的 Ser用 Val替換 ， 其脂酶活性降低了 12倍 。 利用定位突變的方法將 Trichoderma reesei堿性纖維素酶的 Glu13 Asn179和 Asp194 突變?yōu)?Lys， 其熱穩(wěn)定性得到了提高 。 第三節(jié) 體外定向進(jìn)化 一、蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化 ? 定向進(jìn)化與定位突變的不同點(diǎn)是它不需要已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 所以該技術(shù)又稱為非理性設(shè)計(jì) 。 DNA體外進(jìn)化的模式見圖 34。 靶基因 隨機(jī) DNA片段 創(chuàng)造基因多樣性 （隨機(jī)誘變和體外重組） 基因產(chǎn)物分析 選擇 高通量篩選 體外 體內(nèi) 數(shù)據(jù)分析（收集并確認(rèn)陽性克?。? 目標(biāo)產(chǎn)物 進(jìn)一步定向進(jìn)化 隨機(jī)片段化 重組 PCR 圖 34 DNA體外進(jìn)化模式圖 二、 DNA改組 ? DNA 改組 ( DNA Shuffling)又稱 DNA―洗牌 ” ， 是 DNA體外同源重組的一種重組 PCR 技術(shù) 。 見圖 35。 ? DNA改組技術(shù)已廣泛用于改進(jìn)和創(chuàng)制新酶一些特性 ， 在提高酶的活性 、 熱穩(wěn)定性 、 底物特異性 、 對(duì)映體的選擇性及可溶性表達(dá)和表達(dá)水平等方面都已取得了不少成功結(jié)果 。 三、容錯(cuò) PCR ? 容錯(cuò) PCR 是指在利用 Taq聚合酶進(jìn)行目的基因的 PCR 擴(kuò)增的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配 ， 導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變的一種 DNA體外進(jìn)化技術(shù) 。 四、定向進(jìn)化技術(shù)在酶制劑改造中的應(yīng)用 ? 運(yùn)用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)現(xiàn)有酶制劑進(jìn)行改良 ， 已獲得了許多滿意的結(jié)果 。表 34列出了通過定向進(jìn)化技術(shù)研究獲得成功的一些酶制劑 。 表 34 應(yīng)用定向進(jìn)化技術(shù)研究的生物酶制劑 第四節(jié) 融合蛋白技術(shù) 一、融合蛋白概念和用途 ? 融合蛋白 (fusion of proteins)技術(shù)是另一項(xiàng)蛋白質(zhì)工程技術(shù) 。 該技術(shù)是有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因編碼區(qū)首尾連接在一起 ，由同一調(diào)控序列控制所構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物 ， 進(jìn)而表達(dá)所需蛋白 。 利用基因融合表達(dá)外源蛋白主要有以下用途 ： ? 其一 ， 融合蛋白技術(shù)的出現(xiàn)為解決在大腸桿菌等原核生物中表達(dá)出具有生物活性 、 折疊正確的重組蛋白提供了可能 。 ? 其二 ， 外源基因與宿主本身的蛋白的部分序列構(gòu)成融合基因 。 ? 其三 ， 融合蛋白技術(shù)的出現(xiàn)為研究出更多 、 更好的基因工程靶向藥物提供了方便 。 二、融合蛋白技術(shù)的方法 ? （ 一 ） PCR 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成 ， 融合蛋白技術(shù)是利用 DNA連接酶 ， 將把兩段或多段編碼功能蛋白的基因編碼區(qū)首尾連接在一起 ，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物 ， 進(jìn)而表達(dá)所需蛋白 ， 利用重組 PCR方法 （ 見圖 33） 。 ? （ 二 ） 內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成 ，內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成已經(jīng)發(fā)展成蛋白質(zhì)工程研究的通用方法 。 方法見圖 36。 ? 該 方 法 的 原 理 是 ： 將 目 標(biāo) 蛋 白 質(zhì) 用pCYB(bioLabs)作為表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá) ， 產(chǎn)生目標(biāo)蛋白 ， 即蛋白內(nèi)含子 /甲殼素結(jié)合蛋白 ， 圖 36 內(nèi)含子介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子嵌合體形成 三、融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用 ? （ 一 ） 雙功能酶 (多功能酶 ) 對(duì)于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶 ， 可以利用基因融合的方法構(gòu)成的融