【正文】 ? 固體發(fā)酵一般都是開放式的，因而不是純培養(yǎng)，無菌要求不高，它的一般過程為： ? ①將原料預(yù)加工后再經(jīng)蒸煮滅菌， ? ②然后。如：釀酒、制醬等。空氣吸入管通常用一端軸封與葉輪連接，確保不漏氣。自吸式發(fā)酵罐使用的是帶中央吸氣口的攪拌器。 ? 六 發(fā)酵設(shè)備： ? 發(fā)酵缸通常分為機(jī)械攪拌或發(fā)酵缸和通風(fēng)攪拌或發(fā)酵缸。 ? 3 精制： ? 常用的方法的①沉淀②超濾③層析④結(jié)晶。 ? 確定放罐的指標(biāo)有 ：發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，發(fā)酵液的過濾速度，發(fā)酵液中氨基氮的含量，菌絲的形態(tài)，發(fā)酵液的 pH ，外觀和黏度等。這可以通過 控制基質(zhì)的濃度來實(shí)現(xiàn)，如控制補(bǔ)糖速率 。因此可以 控制合適的菌體濃度 ，使得產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率維持在最大值。同時要有適當(dāng)?shù)墓に嚄l件來控制需氧量，使菌體的生長和產(chǎn)物形成對氧的需求量不超過設(shè)備的供氧能力。 ? 要維持一定的濃氧水平，需從供氧和需氧兩方面著手。好氧性微生物在進(jìn)行深層培養(yǎng)時，需要適量的溶解氧以維持其呼吸代謝和某些產(chǎn)物的合成，氧的不足會造成代謝異常，產(chǎn)量降低。這種方法，既可以達(dá)到穩(wěn)定 H值的目的，又可以不斷補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)。如果達(dá)不到要求，還可在發(fā)酵過程中補(bǔ)加酸或堿。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，是引起 pH值變化的重要原因。 ? 2 PH值 ： ? pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響有以下幾方面： ? ①影響酶的活性，當(dāng) pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝； ? ② 影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝產(chǎn)物的排泄； ? ③ 影響培養(yǎng)基中某些組分和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用； ? ④ pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。 四 發(fā)酵工藝控制： ? 1，溫度： ? 溫度對發(fā)酵過程影響 ? ①影響發(fā)酵反應(yīng)速率， ? ②必改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向， ? ③影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制， ? ④影響發(fā)酵液的理化性質(zhì)（如發(fā)酵液粘度，基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速率，某些基質(zhì)的分解和吸收率。 ? ② 反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵 ： ? 是在單一補(bǔ)料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，每隔一定時間按一定比例放出一部分發(fā)酵液，使發(fā)酵液體積始終不超過發(fā)酵缸的最大操作容積，從理認(rèn)上可以延長發(fā)酵周期，直至發(fā)酵產(chǎn)率明顯下降，才最終將發(fā)酵液全部放出。 ? 補(bǔ)料分批發(fā)酵又可分為： 單一補(bǔ)料分批發(fā)酵和反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵 。 ? 缺點(diǎn) ： ? ① 易污染雜菌， ? ②微生易發(fā)生變異， ? ③ 對各種控制元件和技術(shù)在求較高。 ? ④ 減少病菌次數(shù)，測量儀器探頭壽命延長。 ? ②提高自動化降低勞動強(qiáng)度。 ? 2 連續(xù)發(fā)酵 ：是指以一定的速度向發(fā)酵缸內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵缸內(nèi)的液是維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀下生長。 ? 二 發(fā)酵的一般過程： 〈 菌種制備（選已純化或工程菌） —— 發(fā)酵控制 —— 產(chǎn)物提取 〉 ? 三 發(fā)酵的種類（分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵） ? 1 分批發(fā)酵 ： ? 營養(yǎng)物和菌種一次進(jìn)行培養(yǎng)，直到結(jié)束放出，中間除了空氣進(jìn)入和尾氣排出，與外部沒有物料交換。 發(fā)酵工程 ? 發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分，是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)，是一門利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。 ? 開展干細(xì)胞研究一般要經(jīng)過以下三個階段： ? ①獲得干細(xì)胞系：這是本研究最重要的第一些步。如骨髓造血干細(xì)胞可分化成至少十二種血細(xì)胞，但一般不能分化出造血系統(tǒng)以外的其他細(xì)胞。按分化潛能的大小，干細(xì)胞基本上可分三種類型： ? 一類是全能性干細(xì)胞， 即胚胎干細(xì)胞，是最原始的干細(xì)胞，具有自我更新，高度增殖和多向分化發(fā)育成為人體全部 206種組織和細(xì)胞，甚至形成完整個體的分化潛能。 ? 下面主要講一下“細(xì)胞核遺傳全能性”的代表例子“克隆羊”的制作過程 ２．體細(xì)胞克隆 五．染色體轉(zhuǎn)移 １．微細(xì)胞介導(dǎo)法 ? ２．直接轉(zhuǎn)移法 ⑴磷酸鈣沉淀法 ⑵脂質(zhì)體載體法 ⑶顯微注射法 ⑷ DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)。制作過程：（附圖） ? 四．細(xì)胞核移植與動物克隆 ? 細(xì)胞拆合 ：從不同的細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組成，在體外將它們重新組裝成是生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的過程稱為細(xì)胞拆合。 ? 二 . 動物細(xì)胞融合 （主要有三條途徑：病毒誘導(dǎo)融合，化學(xué)誘導(dǎo)融合，電激誘導(dǎo)融合。一定要突出強(qiáng)調(diào)以下的規(guī)定：在一個工作區(qū)內(nèi)不能同時放置兩種以上細(xì)胞株，除非由于細(xì)胞融合等工作需要的暫時存放。建議用慶大霉素或去污劑加以清除。若霉菌蔓延，除小心地鏟除菌落（絲）外，還應(yīng)在培養(yǎng)基中加 制霉菌素 達(dá) 100 U/mL 以抑殺散落的孢子，菌絲。 ? 若安瓿瓶置 70 ℃ 冷存，保活期通常只有幾個月，在 90 ℃ 下培養(yǎng)物可保存半年以上。冷凍保存法珍有操作簡便，保存期長的特點(diǎn)。 ? 5 培養(yǎng)物的長期保存方法基本上有兩大類：經(jīng)典傳代法和冷凍保存法 .Carrel是經(jīng)典傳代法的創(chuàng)始人之一，每隔幾天把雞胚心肌細(xì)胞傳代一次。 ? 無血清培養(yǎng)基 由于必須包括血清中的主要有效成分，因此組成相當(dāng)復(fù)雜，一般包括三大部分： ? ① 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ，大多以 DME培養(yǎng)基與HamF12培養(yǎng)基等量混合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基； ? ② 基質(zhì)因子 ，包括纖黏素，血清鋪展因子，胎球蛋白，膠原和多聚賴氨酸等； ? ③ 生長因子 ，激素和維生素等約 30種有機(jī)和無機(jī)微量物質(zhì)，其中包括哺乳動物的絕大多數(shù)內(nèi)分泌激素。要這種情況下可用 物理法（培養(yǎng)液沖洗，刮刀刮取）或化學(xué)法（ %胰酶解析 )剝離培養(yǎng)組織 ,視組織塊大小進(jìn)行適當(dāng)爭割后再漂洗 ,移置于新培養(yǎng)瓶中 . ? 4 無血清培養(yǎng) ? 上述細(xì)胞和組織的體外培養(yǎng)一般都需添加一定量的血清 ,不僅價(jià)格昂貴易混進(jìn)污染物(包括病毒和病菌 ),而且其成分不能完全確定 ,不同批次的血清之間難以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。（解離液合蛋白酶類，無鈣，鎂離子） 低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)， ? 3 . 培養(yǎng)物的傳代 ? 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞只需定期將其吸移部分到新鮮培養(yǎng)基中即可，比較方便。 ? 2 動物細(xì)胞組織培養(yǎng) ：和細(xì)胞培養(yǎng)類似，主要區(qū)別在于省略蛋白酶對組織離解作用。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是微膠囊內(nèi)細(xì)胞及其產(chǎn)物可不受培養(yǎng)液中血清所含大分子（包括病毒，蛋白質(zhì)等?？赏ㄟ^控制離子交換的時間調(diào)控微膠囊的剛性。將這些微載體與培養(yǎng)基混合均勻，通入無菌空氣，動物細(xì)胞則貼附在微載體表面旺盛地生長，最終，培養(yǎng)基中細(xì)胞的密度可達(dá)到 1000萬個 / 。（解離液合蛋白酶類，無鈣，鎂離子） 低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)， ? 動物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)：貼壁生長。 ? 動原理片 33 動物細(xì)胞工程 ? 定義 ：動物細(xì)胞工程主要從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的層次根據(jù)人類的需要，一方面深入探索，改造生物遺傳特性，另一方面應(yīng)用工程技術(shù)的手段，大量培養(yǎng)細(xì)胞或動物本身，以期收獲細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物以及可供利用的動物。 ? （三）人工種子的貯存與萌發(fā) ? 人工種子的貯存與萌發(fā)是迄今尚未攻克的難關(guān)，一般要將人工種子保存在低溫（ 4~7℃ ）和干燥（相對濕度小于 67%）條件下。 ? （ 3）配制包埋劑及包埋 ? 褐藻酸鈉是目前最好的人工種子包埋劑，它無毒、使用方便，具有一定的保水、透氣性能，價(jià)格較低，經(jīng) CaCl2離子交換后，機(jī)械性能較好。 ? 滲透壓法：隨著植物胚狀體的發(fā)育，其滲透壓值呈現(xiàn)規(guī)律性的從高到低的變化。 ? 分離法 ：在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的適當(dāng)時期，用一定孔徑的尼龍網(wǎng)或鋼絲網(wǎng)或密度梯度離心法，收取處于胚胎發(fā)育某個階段的胚性細(xì)胞團(tuán)，然后轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基上，使多數(shù)胚狀體同步正常發(fā)育。由于低溫阻礙了微管蛋白的合成，紡錘體形成受阻，所以滯留于有絲分裂中期的細(xì)胞增多。如：人工種皮的性能尚不盡人意；還未找到一種符合多數(shù)物種需用要的人工胚乳；胚狀體如何讓它處于健康的休眠狀態(tài)；人工種子怎樣做到既延長其保存時間又不明顯降低萌發(fā)率等。 ? （一）人工種子的構(gòu)成及特點(diǎn) ? 人工種子由以下三部分構(gòu)成： ? （ 1）人工種皮 ? （ 2）人工胚乳 ? （ 3）胚狀體 ? 人工種子具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)： ? ①可以不受環(huán)境因素制約，一年四季進(jìn)行工廠化生產(chǎn)； ? ②由于胚狀體是經(jīng)人工無性繁育產(chǎn)生，因此有利于保存該種系的優(yōu)良性狀； ? ③與試管苗相比，人工種子成本更低，更適合于機(jī)械化田間播種； ? ④可根據(jù)需要在人工胚乳中添加適量的營養(yǎng)物、激素、農(nóng)藥、抗生素、除草劑等，以利于胚狀體的健康生長。在誘發(fā)單倍體植株的各階段（形成愈傷組織、幼胚及小苗），都可用 %~%秋水仙素處理 24~48h ,然后按常規(guī)途徑培養(yǎng) ,即可能得到染色體加倍的能正常開花、結(jié)果的二倍體植株。 ? （四）雜交法獲單倍體植株 ? 雜交，特別是遠(yuǎn)緣朵交，雜種胚在胚胎發(fā)育這程中往往會將一方親本的染色體逐步排除，最終將得到僅含一方染色體的單倍體植物。 ? （二）花粉培養(yǎng) ? 由于花藥培養(yǎng)時一些二倍性的花藥壁細(xì)胞亦形成愈傷組織 ,從而增加了培育單倍體植株的難度 . ? （三）未授粉子房或胚珠的培養(yǎng) ? 子房 ,胚珠中的成熟胚囊由 6個單倍體細(xì)胞 (包括 1個卵細(xì)胞 )和 1個具有 2個極核的中央細(xì)胞構(gòu)成。 ? 適當(dāng)密植花藥是必要的。對多數(shù)植物而言，在 愈傷組織培養(yǎng)基 中一般已添加適量的生長素類激，如 2，4D，奈乙酸或吲哚丁酸等，花藥可以在這種培養(yǎng)基中去分化而長成愈傷組織，但通常不會長成單倍體植株；但有些植物，如煙草、曼陀羅等則只需 在簡單的蔗糖和無機(jī)鹽培養(yǎng)基上即可完成從花粉去分化、 單倍體胚的形成乃至單倍體植株的長出這一完整的過程。 ? （ 2）花藥預(yù)處理 花藥經(jīng)無菌操作從上述材料中取出后，經(jīng)下述方法之一進(jìn)行預(yù)處理： ? ①用甘露醇或其他糖、無機(jī)鹽配成的高滲溶液（約 25%的質(zhì)量濃度）處理 6~8 min，或者低速（ 2022r/min）離心 30 min ，將有利于單倍體愈傷組織的形成； ? ②低溫（ 4~10℃ ）或高溫（ 35℃ ）處理 2~20天，可明顯提高某些植物單倍體胚的比例； ? ③零磁處理利用航天器將培養(yǎng)中的花藥送入太空一段時間（幾天）后再回收有助于獲得高質(zhì)量的愈傷組織及其再生苗。 ? （一）花藥培養(yǎng) ? （ 1）選取成熟度適中的花蕾或幼穗 所謂成熟度適中是指花蕾或幼穗中的花粉正處于形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞的階段（對多數(shù)植物而言）。 ? （ 3） 無融合生殖 精卵結(jié)合后，不僅受精卵發(fā)育，由于某種原因，助細(xì)胞或反足細(xì)胞也與受精卵形成的二倍體胚同步發(fā)育成單倍體胚，形成 雙胚或多胚種子。它們通常經(jīng)以下途徑發(fā)育而成： ? （ 1） 孤雌繁殖途徑 植物卵細(xì)胞不經(jīng)受精而發(fā)育成單倍體胚，繼而長成單倍體植物。在育種中培植利用單倍體生物，然后加倍獲得正常二倍體植株的設(shè)想。單倍體植物比單倍體動物多見。 ? ⑶ 細(xì)胞分子生物學(xué)鑒別 ? 經(jīng)細(xì)胞融合后長出的愈傷組織或植株，可進(jìn)行染色體核型分析、染色體顯帶分析、同工酶分析以及更為精細(xì)的核酸分子雜交、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（ RAPD）分析。 ? ⑵互補(bǔ)法篩選 遺傳互補(bǔ)法的前提是獲得各種遺傳突變細(xì)胞株系。若一方細(xì)胞基本無色 ,另一方為綠色 ,則白綠色結(jié)合的細(xì)胞是雜合細(xì)胞質(zhì) 。鑒別雜合體的方法有四種 （顯微鏡鑒別，互補(bǔ)法篩選，細(xì)胞分子生物學(xué)鑒別，根椐植株形態(tài)特征鑒別 。此時瞬間施以適當(dāng)?shù)碾娒}沖，別使原生質(zhì)體質(zhì)膜被 穿而發(fā)生融合。 ? （ 2）電激融法 ：將雙親原生質(zhì)體的適當(dāng)?shù)娜芤簯腋』旌虾?，插入微電極，接通一類的高變電 。通過以上觀測，基本上可判別中否原生質(zhì)體及其百分率。 ⑸鑒定 只有經(jīng)過鑒定確認(rèn)已獲得原生質(zhì)體后才能進(jìn)行下階段的細(xì)胞融合工作。為了取得高純度的原生質(zhì)體就必需進(jìn)行原生質(zhì)體的分離，可選取 200~400目的不銹鋼網(wǎng)或尼龍布進(jìn)行過濾除渣，也可采用低速離心法或比重漂浮法直接獲取原生質(zhì)體。 ⑵酶解 由于植物細(xì)胞和細(xì)胞壁含纖維、半纖維、本質(zhì)素以及果膠質(zhì)等成分，因此市售的纖維素酶實(shí)際上大多是含多種成分的復(fù)合酶。 ? 1 原生質(zhì)體的制備 （取材和除菌 —— 酶解 —— 分離 —— 洗滌 —— 鑒定） ? （用過濾把原生質(zhì)體和殘留組織塊和破碎細(xì)胞分離） ⑴ 取材和除菌 原則上植物任何部位的外植體都可成為制備原生質(zhì)體的材料。制成一個個 1—— 2——3的細(xì)胞團(tuán)塊，并將它們集中于細(xì)菌立柱中（掃描 70頁） ? 動畫原理 ? 三 植物細(xì)胞原生質(zhì)