生物技術(shù)制藥ppt課件(2)(參考版)
2025-01-11 04:55本頁面
【正文】 比如 ELISA方法（夾心法、間接法）。 ? （ 1）免疫酶染色法用抗體診斷試劑：常用的酶為 HRP， 其底物為二氨基聯(lián)苯胺（ DAB）， 兩者作用可生成棕褐色沉淀物質(zhì)，使抗原呈色。 ? （ 1）熒光抗體的制備 ? （ 2）免疫熒光測定法有直接和間接兩種方法。免疫標記技術(shù)有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù) 二、免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 熒光抗體診斷試劑 ? 熒光色素如異硫氰酸熒光素（ FITC） 等標記抗體球蛋白，即成為熒光抗體。 三、基因工程抗體的表達 ? 原核細胞表達 ? 真核細胞表達 ? 轉(zhuǎn)基因植物表達 ? 轉(zhuǎn)基因動物表達 第五節(jié) 抗體診斷試劑 ? 一、血清學鑒定用的抗體類試劑 ? 鑒定病原菌的抗體試劑：診斷血清制備步驟：（ 1）制備細菌抗原， O（ 菌體）抗原， H（ 鞭毛）抗原；（ 2）免疫動物和制備抗體血清 ? 乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg） 的反向被動血凝診斷試劑 ? 妊娠診斷試劑 ? 抗 ABO血型系統(tǒng)血清 二、免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)方法難以觀察或檢測的反應得以顯現(xiàn)，因而大幅度提高抗原抗體反應的敏感性，用于對微量抗原物質(zhì)進行定性或定量檢測，結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細胞內(nèi)的定位測定。 VH和 VL隨機重組增加抗體的多樣性。 二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點 ? 模擬天然全套抗體庫 ? 抗體文庫 ?1011庫容，能包含 B細胞全部克隆。 ? 淘篩：抗原固定化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量擴增。如加入一段有疏水性和一定伸展性的長鏈，可緩解兩種蛋白的相互干擾。在抗體的 N端和 C端融合其它蛋白都可以獲得成功。其中較為成熟的是配基 Ig型嵌合蛋白，而酶 抗體型融合蛋白（即抗體酶， abeneyme） 在藥物治療中應用前景廣闊，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，避免對正常組織的傷害，此法稱為抗體介導的酶前體藥物治療。（ 40受體FV型融合蛋白。（ 2） 配基 Ig嵌合型蛋白，如 IL2Ig。 ? 基因工程方法 采用適當?shù)慕宇^連接不同抗體的 VH和 VL區(qū)，使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對，讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對，構(gòu)建雙特異性（ SCFV)2。 它是一種非天然性的抗體，其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。（ 5）最小識別單位（ MRU）是由單個 CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體，親和力較低。有分子量小、穿透力強、免疫原性小特點，可與效應分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。（ 2） FV抗體，由 VH和 VL組成，天然 FV片段中 VH和 VL為非共價性結(jié)合。也就是說，保留了 CDR區(qū)，而 Ig分子的 C區(qū)不表達。書中表 45給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應用?？贵w分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。 H和 L鏈各有三個 CDR， 其他部分稱為框架區(qū)。如若用人 IgG1或IgG3的 C基因替換鼠 IgG1或 IgG2b， 則可有效地加強多肽的 ADCC效應與免疫調(diào)理作用。 一、人 鼠嵌合抗體 ? 制備方法：提取雜交瘤細胞系的 mRNA， 經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 并以其為模板，采用特異引物，用 PCR方法分別擴增 VL和 VH基因，再分別連接真核表達所需的上游啟動子、前導肽序列和下游剪切供體信號、增強子真核調(diào)控序列后，將 VL基因克隆到人 Ig的 CL基因表達載體上，將 VH基因克隆到人 IgG1的 C基因真核表達載體上，再將人 鼠嵌合的 VC區(qū)基因質(zhì)粒 DNA等量混合，在脂質(zhì)體介導下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞 SP2/0， 轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進行篩選，形成集落的細胞即為共轉(zhuǎn)染細胞，所分泌的抗體為嵌合抗體。 ? 如將鼠源性單克隆抗體的 C區(qū)用人的 Ig分子的 C區(qū)置換，則對人的免疫原性消失。 用蛋白 A親和層析收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。 ? （ 3）親和層析 ? 多用蛋白 A親和層析，適用于 IgG類單克隆抗體的純化。 ? 續(xù)（ 2）離子交換法 ? 在最適離子強度及 pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化 25~100倍。 IgG2b、 IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。 ? （ 2）陰離子交換層析 用于 IgG類單克隆抗體的分離純化。 六、單克隆抗體的純化 ? 分離 ? （ 1）凝膠過濾 用于 IgG和 IgM類單克隆抗體的分離純化。 六、單克隆抗體的純化 ? 動物體內(nèi)誘生法
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