【文章內容簡介】 τκ在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。 DNApol 二、 DNA連接酶（ DNA ligase） *作用是連接 DNA分子 ， 將相鄰的 3′OH和 5′P連接成磷酸二酯鍵 ， 封閉缺口 。 其作用過程分三步進行： 1. E＋ ATP→E － AMP＋ ppi 在 ： E＋ NAD→E － AMP＋ NMN 2. EAMP上的 AMP轉移到 DNA的 5’PO4上使其活化； 3. 活化的 5’PO4與相鄰的 3’OH作用形成 3’－ 5’ 磷酸二酯鍵 ， 并釋放出 AMP。 *此酶在后隨鏈的合成 、 DNA的損傷修復 、 重組及轉座中發(fā)揮重要的作用 。 29 ① 需一段 DNA片段具有 339。OH， 而另一段 DNA片段具有 539。Pi； ② 需要消耗能量 ， 在原核生物中 由 NAD+供能 ，在真核生物中 由 ATP供能 。 ③ 未封閉的 切口位于雙鏈 DNA中 ， 即其中有一條鏈是完整的； DNA連接酶的催化特點： 30 DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用 。 在 DNA修復 、 重組及剪接中也起縫合缺口作用 。 是基因工程的重要工具酶之 一 。 DNA連接酶的作用： 三、螺旋酶（ helicase） 又稱解旋酶，是解開氫鍵促進 DNA的兩條互補鏈分離的酶。 ? 是 DNA復制、重組、修復過程中關鍵的發(fā)動蛋白； ? 具有依賴 DNA的 ATPase活性，利用 ATP水解產(chǎn)生的能量解旋 DNA并使螺旋酶沿 DNA鏈移動。一般每解開一對堿基需要水解一個 ATP。 與產(chǎn)物單鏈 DNA結合，如螺旋酶 Ⅰ ，螺旋酶 Ⅱ 。 螺旋酶 僅僅催化 DNA雙鏈的分離，常與 SSB蛋白結合 如 中 rep蛋白，螺旋酶 Ⅲ 。 表 1 1 3 E . c o l i 及噬菌體的解旋酶 解 旋 酶 結 構 功 能D n a B 3 3 0 K 六聚體 結合與 O r i C , O r i λ 參與前引發(fā)分離雙鏈，水解 ATP , 提供能量。rep 蛋白 66 K 單體 ATP 依賴性解旋酶，在 φ X 1 7 4 滾環(huán)復制中推進復制叉P r i A ( w 蛋白 ) 82 K 單體 φ X 1 7 4 R f 形成中參與前引發(fā)體 3 ’→ 5 ′移動取代 S S B ，識別特異位點。T r a Y / I 多聚體 F 因子滾環(huán)復制中解鏈。基因 4 蛋白 58 K T7 噬菌體復制中延 5 ’ → 3 ′解鏈。 四、單鏈結合蛋白 SSB （ single binding protein） 單鏈結合蛋白：又稱雙螺旋去穩(wěn)定蛋白 (helix destabilizing protein)，可以結合單鏈ＤＮＡ，防止形成雙鏈或發(fā)夾結構，同時保護單鏈ＤＮＡ不被核酸酶水解。 ? 在 中， SSB是由 177個 aa組成的蛋白質 。 以四聚體存在 。分子量為 74KDa。結合單鏈 DNA可覆蓋 32nt，保護 DNA。 ? 在原核中 SSB與 DNA結合表現(xiàn)出協(xié)同效應（第一個 SSB的結合能力是 1，則第二個 SSB的結合能力為 1000）： （ 1） SSB之間的相互作用； （ 2） 第一個 SSB和 DNA的結合改變了 DNA的結構 。 ? 真核生物的復制系統(tǒng)中具有復制因子 A（ RFA）相當于 SSB，但無協(xié)同作用。 34 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。 DNA復制的拓撲性質 五、拓撲異構酶 35 ? DNA復制時，兩條鏈打開，必然造成 DNA分子形成纏繞、打結、連環(huán)等現(xiàn)象，從而產(chǎn)生扭曲張力。 ? 閉環(huán)狀的 DNA按一定方向扭轉形成超螺旋。盤繞過分稱為正超螺旋，盤繞不足為負超螺旋。復制時，部分 DNA要呈松弛狀態(tài)。 36 拓撲異構酶的作用特點 : 既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵 *拓撲異構酶 Ⅰ *拓撲異構酶 Ⅱ 拓撲異構酶 Ⅲ 分 類 拓撲異構酶（ topoisomerase） 拓撲異構酶：催化 DNA環(huán)的拓撲異構體之間轉化的酶，它可以在切割 DNA的單鏈或雙鏈后，催化一個 DNA分子單鏈或雙螺旋鏈穿過斷裂的單（雙）鏈再重新閉合。 37 拓撲異構酶 ?? 切斷 DNA雙鏈中 一股 鏈，使 DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口， DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài) 。 反應 不需 ATP。 如大腸桿菌 DNA拓撲異構酶 Ⅰ 。 拓撲異構酶 ?? 無 ATP時，切斷 DNA分子 兩股 鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。 利用 ATP供能時，使松弛 DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)，連接斷端。 如大腸桿菌的 DNA旋轉酶 (gyrase)又稱 DNA 拓撲異構酶 Ⅱ 。 DNA拓撲異構酶的作用機制 38 小結： 參與 DNA復制的酶和蛋白質 主要成員 功 能 DnaA 識別復制起始位 點 解螺旋酶 解開 DNA雙鏈 SSB 維持已解開單鏈 DNA的穩(wěn)定 引物酶 合成 RNA引物 拓撲異構酶 使打結、纏繞、正超螺旋的 DNA松馳 DNApol Ⅲ DNA復制延長中起主要作用 DNApolⅠ 水解引物、填補空隙、修復作用 DNA連接酶 催化雙鏈 DNA中單鏈缺口的連接 第四節(jié) 原核生物和病毒的復制 ? 原核細胞染色體 DNA的復制起始于固定位點，雙向復制； ? 噬菌體、病毒核酸的復制可以起始于不同位點，雙向或單向復制，也可以采取特殊的復制方式，如 滾環(huán)復制 。 ? 大腸桿菌 環(huán)狀 DNA分子 ? F質粒 (F因子 )環(huán)狀 DNA分子 ? λ 噬菌體 有環(huán)狀 DNA分子也有線狀 DNA ? 腺病毒 線狀 DNA分子 40 DNA復制時，在 DNA合成的復制叉上，分布有各種各樣與復制有關的酶和蛋白因子，它們構成的復合物稱為 復制體。 Dna A Dna B Dna C DNA拓撲異構酶 SSB 3 5 3 5 復制體結構的變化形成復制的不同階段。大腸桿菌 DNA的復制分為三個階段： 起始 、 延伸 和 終止 。 一、 大腸桿菌環(huán)狀 DNA復制的過程 41 需要解決兩個問題： 1. DNA解開成單鏈，提供模板 2. 合成引物，提供 339。OH末端 （一）起始階段 42 1．解旋解鏈，形成復制叉 復制起始位點 oriC的結構特點 : E. coli的復制起點跨度為 245bp ? 包括 3組 13bp串聯(lián)重復序列和 2對 9bp反向重復序列 作為蛋白結合位點； ? 富含 A－ T，這可能和雙鏈易于解開起始復制有關； GATCTNTTNTTT TCTGGATA A T TtGG A TAA R 1 R 3 L M R 1 2 3 4 2 3 6 2 8 0 8 8 1 8 6 1 9 4 2 3 1 2 3 9 2 6 0 2 6 8 R 2 R 4 A A T A