分子克隆載體ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-02 08:12 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 TGNATGN ATG 123 456 5’… ATGN ATG NAT GXY 123 456 5’… ATG NAT GNA TGZ 123 456 能正確讀出三聯(lián)體密碼的起始序列 TAA ATG I II III IV V I V I II V ATG I II III V I II III Ori 轉(zhuǎn)錄起始 翻譯起始 信號(hào)肽 成熟蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄終止區(qū) CS CS CS CScloning site 質(zhì)粒 (plasmid ) Plasmid 獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán) DNA分子。 Plasmid chromosome 基因載體應(yīng)具備的條件： （ 1） 有多種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn) ， 但每種切口最好只有 1個(gè)； （ 2） 有選擇標(biāo)記 ， 例如抗藥性標(biāo)記 ， 藍(lán)白斑試驗(yàn)； （ 3） 有一定容量； （ 4） 有相當(dāng)?shù)某緮?shù) ， 即每個(gè)宿主菌可能容納的最多數(shù) 。 多克隆位點(diǎn) ori 復(fù)制起始點(diǎn) 遺傳標(biāo)記 Amp polylinker 基因載體 質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能 自主復(fù)制 的環(huán)形雙鏈 DNA分子。 編碼 抗菌素抗性基因 的質(zhì)粒叫 R質(zhì)粒 。 質(zhì)粒 DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。 質(zhì)粒 DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的 穿梭質(zhì)粒 ，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。 質(zhì)粒的生物學(xué)特性 根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒 （拷貝數(shù)少，為 15個(gè)）與 松弛型復(fù)制質(zhì)粒 （拷貝數(shù)多，可達(dá) 10200個(gè)拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。 質(zhì)粒的 不親和性 ：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 第一階段（ 1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322。 第二階段： 增大載體容量 （降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū) 和新的 遺傳標(biāo)記 基因。如 pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7， sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。 發(fā)展概況 pBR322為 DNA， 其堿基序列已經(jīng)全部清楚 。 是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一 。 把 pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段 ， 換上合用的 表達(dá)組件 ， 就可以構(gòu)建成工作所需的新載體 。 許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在 pBR322的基礎(chǔ)上改建而成 。可見其原型質(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn) 。 pBR322 有過(guò)百個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有 單一切口的位點(diǎn)也多達(dá)數(shù)十個(gè)， 幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。 此外， pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 。 普通型載體 pBR322的結(jié)構(gòu)圖 pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b)抗藥性標(biāo)志的選擇 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 重組D N AA m p
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