【文章內(nèi)容簡介】 在平臺期前結束反應， 減少非特異性產(chǎn)物。 擴增效率 PCR擴增產(chǎn)物的分析 ? 凝膠電泳分析 (1) 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用 1～ 2%的瓊脂糖 凝 膠， 供檢測用。 (2) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）： 6～ 10%聚 丙烯酰胺凝膠 電泳分離效果較瓊脂糖好 ? 酶切分析 ? 分子雜交 ? 測序 ?功能 ?引物設計 ?限制性內(nèi)切酶位點分析 ?DNA基序 (motif)查找 ?同源性分析 常規(guī) PCR技術及幾類 PCR新技術 ?熱啟動 PCR ?Touchdown PCR ?RTPCR ?簡并引物 PCR ?巢氏 PCR ?反向 PCR ?不對稱 PCR ?原位 PCR ?連接酶鏈反應 ?RACEPCR ?AFLP ?免疫 PCR(immunoPCR) 熱啟動 PCR是除了好的引物設計之外，提高 PCR特異性最重要的方法之一。盡管 Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在 72℃ ，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行 PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如 sitedirected突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動 PCR尤為有效。 限制 Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR反應液，并將其置于預熱的 PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。 熱啟動 PCR 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲 DNA合成，直到 PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入 Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。 Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動 PCR來說方便高效。 Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復合有抗 Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組 Taq DNA聚合酶。此酶在常溫下活性被封閉，要在 94℃ － 95℃ 下加熱數(shù)分鐘才能夠恢復酶活性。 同經(jīng)化學修飾用于熱啟動的 Taq DNA聚合酶相比， Platinum酶不需要在 94℃ 延時保溫（ 10到 15分鐘）以激活聚合酶。使用 PlatinumTaq DNA聚合酶，在 94℃ 進行 2分鐘就可以恢復 90％的 Taq DNA聚合酶活性。 熱啟動 PCR Touchdown PCR又稱降落 PCR。即 選定一個溫度范圍，如 50— 35 ℃ ，每 降 12 ℃ 進行 12個 循環(huán)，然后在 50度下進行 15個 循環(huán)。 Touchdown的 原理 ： 隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴增出來，其濃度遠遠超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴增。 選擇初始復性溫度的原則：起始復性溫度應該比引物的Tm值高出 510度，然后每個循環(huán)遞減 12度 Touchdown PCR ?low copy of targeted DNA。 ?high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers。 ?RTPCR using oligodT. Touchdown PCR的應用范圍 RTPCR RNA的多聚酶反應（ RTPCR）是以 RNA 為模板，聯(lián)合逆轉錄反應 （ reverse transcription， RT）與 PCR，可用于檢測單個細胞或少數(shù) 細胞中少于 10個拷貝的 RNA模板。 RNA擴增包括兩個步驟： ?在單引物的介導下和逆轉錄酶的催化下，合成 RNA的互補cDNA ?加熱后 cDNA與 RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚 合酶催化引物延伸生成雙鏈靶 DNA， 最后擴增靶 DNA Double strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNA RTPCR A. Double strand DNA B. Denature 96186。 50186。 C. Anneal primers 50186。 D. Polymerase binds 72186。 Taq Taq RTPCR cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種 : (1) 自身引導法 合成的單鏈 cDNA 3 ’ 端能夠形成一短的發(fā)夾結構 ,這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物 ,當?shù)谝绘満铣煞磻a(chǎn)物的 DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段或反轉錄酶合成 cDNA第二鏈 ,最后用對單鏈特異性的 S1核酸酶消化該環(huán) ,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用 S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于 mRNA 5’ 端序列出現(xiàn)缺失和重排 ,因而該方法目前很少使用。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產(chǎn)生的 cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性 ,而是在 dNTP存在下 ,利用RNA酶 H在雜交鏈的 mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物 ,使之成為合成第二鏈的引物 ,在大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有 3個主要優(yōu)點 : (1) 非常有效 。 (2) 直接利用第一鏈反應產(chǎn)物 ,無須進一步處理和純化 。 (3) 不必使用 S1核酸酶來切割雙鏈 cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。 RTPCR ?RTPCR— 優(yōu)化條件 模板 ：作為模板的 RNA分子必須是完整的，并且不含 DNA、蛋白和其他雜質(zhì)。 RNA中即使含有最微量的 DNA，經(jīng)擴增后也會出現(xiàn)非特異性擴增；蛋白若未除干凈，與 RNA結合后會影響逆轉錄和 PCR；殘留的RNase極易將模板 RNA降解掉。 逆轉錄酶： 1)目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒 (AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒 (MLV)反轉錄酶。 AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基 ,這些活性包括依賴于 RNA的DNA合成 ,依賴于 DNA的 DNA合成以及對 DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內(nèi)切降解 (RNA酶 H活性