【文章內(nèi)容簡介】 在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。 擴(kuò)增效率 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 ? 凝膠電泳分析 (1) 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用 1～ 2%的瓊脂糖 凝 膠， 供檢測用。 (2) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）： 6～ 10%聚 丙烯酰胺凝膠 電泳分離效果較瓊脂糖好 ? 酶切分析 ? 分子雜交 ? 測序 ?功能 ?引物設(shè)計 ?限制性內(nèi)切酶位點分析 ?DNA基序 (motif)查找 ?同源性分析 常規(guī) PCR技術(shù)及幾類 PCR新技術(shù) ?熱啟動 PCR ?Touchdown PCR ?RTPCR ?簡并引物 PCR ?巢氏 PCR ?反向 PCR ?不對稱 PCR ?原位 PCR ?連接酶鏈反應(yīng) ?RACEPCR ?AFLP ?免疫 PCR(immunoPCR) 熱啟動 PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高 PCR特異性最重要的方法之一。盡管 Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在 72℃ ，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行 PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如 sitedirected突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動 PCR尤為有效。 限制 Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的 PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。 熱啟動 PCR 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲 DNA合成，直到 PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入 Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動 PCR來說方便高效。 Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復(fù)合有抗 Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組 Taq DNA聚合酶。此酶在常溫下活性被封閉，要在 94℃ － 95℃ 下加熱數(shù)分鐘才能夠恢復(fù)酶活性。 同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動的 Taq DNA聚合酶相比， Platinum酶不需要在 94℃ 延時保溫（ 10到 15分鐘）以激活聚合酶。使用 PlatinumTaq DNA聚合酶，在 94℃ 進(jìn)行 2分鐘就可以恢復(fù) 90％的 Taq DNA聚合酶活性。 熱啟動 PCR Touchdown PCR又稱降落 PCR。即 選定一個溫度范圍，如 50— 35 ℃ ，每 降 12 ℃ 進(jìn)行 12個 循環(huán)，然后在 50度下進(jìn)行 15個 循環(huán)。 Touchdown的 原理 ： 隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。 選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出 510度，然后每個循環(huán)遞減 12度 Touchdown PCR ?low copy of targeted DNA。 ?high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers。 ?RTPCR using oligodT. Touchdown PCR的應(yīng)用范圍 RTPCR RNA的多聚酶反應(yīng)（ RTPCR）是以 RNA 為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) （ reverse transcription， RT）與 PCR，可用于檢測單個細(xì)胞或少數(shù) 細(xì)胞中少于 10個拷貝的 RNA模板。 RNA擴(kuò)增包括兩個步驟： ?在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成 RNA的互補cDNA ?加熱后 cDNA與 RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚 合酶催化引物延伸生成雙鏈靶 DNA， 最后擴(kuò)增靶 DNA Double strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNA RTPCR A. Double strand DNA B. Denature 96186。 50186。 C. Anneal primers 50186。 D. Polymerase binds 72186。 Taq Taq RTPCR cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種 : (1) 自身引導(dǎo)法 合成的單鏈 cDNA 3 ’ 端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu) ,這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物 ,當(dāng)?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的 DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA第二鏈 ,最后用對單鏈特異性的 S1核酸酶消化該環(huán) ,即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用 S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于 mRNA 5’ 端序列出現(xiàn)缺失和重排 ,因而該方法目前很少使用。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的 cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性 ,而是在 dNTP存在下 ,利用RNA酶 H在雜交鏈的 mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物 ,使之成為合成第二鏈的引物 ,在大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有 3個主要優(yōu)點 : (1) 非常有效 。 (2) 直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物 ,無須進(jìn)一步處理和純化 。 (3) 不必使用 S1核酸酶來切割雙鏈 cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。 RTPCR ?RTPCR— 優(yōu)化條件 模板 ：作為模板的 RNA分子必須是完整的，并且不含 DNA、蛋白和其他雜質(zhì)。 RNA中即使含有最微量的 DNA，經(jīng)擴(kuò)增后也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；蛋白若未除干凈，與 RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和 PCR；殘留的RNase極易將模板 RNA降解掉。 逆轉(zhuǎn)錄酶： 1)目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒 (AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒 (MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。 AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基 ,這些活性包括依賴于 RNA的DNA合成 ,依賴于 DNA的 DNA合成以及對 DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解 (RNA酶 H活性