高效液相色譜法進(jìn)展及其在衛(wèi)生檢驗中的應(yīng)用孫成均(編輯修改稿)
2025-05-29 06:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 好 —— 導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。 ?物理損傷或受熱引起的缺口 —— 導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。 ?對硅膠基質(zhì)或鍵合相的 化學(xué)腐蝕 —— 導(dǎo)致選擇性變?nèi)?、峰形拖尾、保留能力下降（或?qū)A性化合物的保留能力增強）。 Sichuan University 色譜柱的保養(yǎng) ?不能碰撞、彎曲或強烈震動色譜柱；否則柱內(nèi)填料床層產(chǎn)生裂縫和空隙，會使色譜峰出現(xiàn) “ 駝峰 ” 或 “ 對峰 ” 。 ?色譜柱和色譜儀相連時，閥件或管路定要清洗干凈； ?如無在線脫氣裝置，需將流動相脫氣后使用； ?避免使用高粘度溶劑作為流動相，否則增加柱壓； Sichuan University 色譜柱的保養(yǎng) ?樣液要提純。盡可能用色譜純試劑。另外使用預(yù)柱，可延長色譜柱壽命。如流動相為水溶液，細(xì)菌易生長，加入 ％ Na3N能防止能防止細(xì)菌生長； ?對硅膠基鍵合相填料，水溶液流動相的 pH值不得超出 2～ 8，使用溫度不宜過高。在酸性或堿性條件下使用后，應(yīng)依次用水、甲醇清洗； ?若柱子長期不用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉。 Sichuan University 色譜柱的再生 直接 將色譜柱連接到泵，每種溶劑至少用 20倍柱體積 （如 250mm ）。 ?極性固定相 (如 Si， NH2， CN基色譜填料 )的再生 ： 正庚烷 ? 三氯甲烷 ?乙酸乙酯 ? 丙酮 ?乙醇 ? 水 ?非極性固定相 (如反相 C18， C8等 )的再生： 水 ?乙腈 ?三 氯甲烷 (或異丙醇 ) ?乙腈 ? 水 Sichuan University 4. 檢測器 一般要求： 檢測器用于連續(xù)檢測從色譜柱流出的物質(zhì) ， 以進(jìn)行定性定量分析 。 要求其靈敏 、 響應(yīng)快 、 噪聲低 、 基線穩(wěn)定 、 線性范圍寬等 。 Sichuan University 紫外檢測器 (UVD) 普通 紫外檢測器 用單色器分光 ， 只讓特定波長的光進(jìn)入流動池 。 二極管陣列檢測器 (diode array detector, DAD)， 由 3111024個二極管組成 。 它以光電二極管陣列為檢測元件 。 先讓全波長光通過流動池 ， 然后通過一系列分光技術(shù) ， 使光在接受器上被檢測 ， 然后 ， 對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù) ， 得到時間 、 光強度和波長的三維譜圖 。DAD可提供部分定性信息 ， 可進(jìn)行色譜峰的純度分析 ， 消除漂移 ， 分離雜質(zhì) ， 準(zhǔn)確定量 。 Sichuan University 紫外－可見光檢測池 Sichuan University 二極管陣列檢測器及三維光譜圖 Sichuan University 熒光檢測器 （ fluorescence detector， FLD） 熒光檢測器原理：物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后 ， 被激發(fā)至較高能態(tài) ， 但不穩(wěn)定很快又從高能態(tài) 躍遷至低能態(tài) ，同時發(fā)出比入射光波長較長的光 ， 這種光稱為熒光 。 在其他條件一定的情況下 ， 熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比 。 Sichuan University 示差折光檢測器原理 ?示差折光檢測器 是基于純?nèi)軇?（ 流動相 ）的折射率與柱流出物 （ 含溶質(zhì)的流動相 ）的折射率存在差異的 原理 ， 連續(xù)地檢測柱流出物折射率變化的檢測器 。 特點 ：通用性強 ， 操作簡便；但靈敏度低 ，不適用于梯度洗脫 。 Sichuan University 示差折光檢測器 (refractive index detector， RID) 偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器原理圖 經(jīng)過流通池的折射光被透鏡聚焦，在光電檢測器上產(chǎn)生與光電位置成正比的電信號。檢測室和參比室折射率相同或不同時，光偏轉(zhuǎn)角度不同，到達(dá)光電檢測器上光點位置發(fā)生變化，從而產(chǎn)生大小不同的微弱光電流，經(jīng)放大后記錄下來。 Sichuan University 蒸發(fā)光散射檢測器 (ELSD) ?工作原理 ：將色譜柱流出液引入霧化器與通入的高純氦混合形成均勻微小液滴 ， 經(jīng)加熱蒸發(fā)除去流動相 。 而樣品組分形成氣溶膠 ，進(jìn)入檢測室 。 用激光照射氣溶腋 ， 產(chǎn)生光散射 ， 用光電二極管檢測散射光 。 ?該檢測器適用于揮發(fā)性低于流動相的組分 ，可用于檢測糖類 、 高級脂肪酸 、 磷脂 、 維生素 、 氨基酸 、 甘油三酯及甾體等；但靈敏度較低 ， 要求流動相必須是揮發(fā)性的 ， 不能含緩沖鹽類 。 Sichuan University 蒸發(fā)光散射檢測器 Sichuan University 電化學(xué)檢測器 (electrochemical detector， ECD) ECD 為一種靈敏的檢測器。根據(jù)電化學(xué)原理，色譜柱流出物的響應(yīng)值隨電位的變化而不同，在一定電位條件下，可得到不同保留時間的色譜圖，靈敏度可達(dá) pg水平。 Sichuan University 質(zhì)譜檢測器 (mass detector， MSD) 質(zhì)譜把待測物質(zhì)分子轉(zhuǎn)變成帶電粒子 ， 利用穩(wěn)定磁場 (或交變電場 )使帶電粒子按 質(zhì)荷比大小順序分離開 ， 形成有規(guī)則并可以檢測的質(zhì)量色譜 。 該法對單一組分有很強的鑒別力 。 HPLC和 MS聯(lián)用的關(guān)鍵是 接口 (Interface)。由于 HPLC流動相的組成比 GC載氣復(fù)雜 ， 因此 ， 對 HPLCM S的接口技術(shù)則要求更高 。 Sichuan University 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 Sichuan University HPLC現(xiàn)有的主要接口 熱噴霧接口 (Thermospary， TS) 由 HPLC色譜柱流出的極性溶液進(jìn)入不銹鋼毛細(xì)管后 ， 經(jīng)加熱蒸發(fā)呈帶正電荷的霧滴 /氣溶膠 ， 在一定能量下 ， 溶劑則被油泵抽走 ，正離子進(jìn)入離子源 。 適合于含有大量水的流動相，可用于測定各種極性化合物。 Sichuan University 將色譜流出物轉(zhuǎn)化為氣溶膠，于脫溶劑室脫去溶劑，得到的中性待測物分子導(dǎo)入離子源，使用電子轟擊或者化學(xué)電離的方式將其離子化，獲得的質(zhì)譜為經(jīng)典的電子轟擊電離或者化學(xué)電離質(zhì)譜圖。適用于分子量在 1000Da以下的有機小分子測定。 粒子束接口 (Particle Beam， PB) Sichuan University 電噴霧接口 (Electrospary， ES) 帶有樣品的色譜流動相通過一個帶有數(shù)千伏高壓的針尖噴口噴出，生成帶電液滴，經(jīng)干燥氣除去溶劑后，帶電離子通過毛細(xì)管或者小孔直接進(jìn)入質(zhì)量分析器。電噴霧接口主要適用于微柱液相色譜。可分析分子量高達(dá)幾十萬道爾頓（ Da）的物質(zhì)。 。 Sichuan
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