生化實驗ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 13:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 Argose膠電泳鑒定 PPO提取、純化 材料 馬鈴薯（大約每小組 100200g） 試劑： 磷酸緩沖液 A（ , ,含 ， EDTA， 5％甘油， 1％的聚乙烯吡咯烷酮） 固體硫酸銨 磷酸緩沖液 B (, ,含 ， EDTA， MgCl2） 粗酶提取 土豆按 1:1（ W/V） 比例與磷酸緩沖液勻漿 2層紗布過濾 濾液以 6000rpm離心 10min 棄除沉淀獲得酶提取液 。 純化 I鹽析分級沉淀 酶粗提液中加固體硫酸銨到 40％ 飽和度 6000rpm離心 20min棄除沉淀 上清液再加入固體硫酸銨達到 70％ 飽和度 6000rpm離心 20min， 棄除上清液 ， 得粗酶沉淀 沉淀用 10ml磷酸緩沖液 B復(fù)溶 裝入透析袋 用 KCl溶液透析至無硫酸銨根離子 得初步純化 PPO液 純化 II分子篩凝膠層析 柱材處理 Sephadex G－ 100干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹 2448h，去掉懸浮的細微顆粒 凝膠液脫氣體除 平衡 TrisHCl 緩 沖 液 （ 內(nèi)含 EDTA） 平衡 ，保持液面比膠面高 12cm 裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加 1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通 將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部 凝膠沉積直到離層析柱上端－ 2 cm處， 保持液面比膠面高 12cm ，停止裝柱，剪一與柱內(nèi)徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上 純化 II分子篩凝膠層析 樣品處理： 初步純化 PPO液留 1ml， 4 ℃ 保存；余下樣品反滲至 2ml 測定 考馬斯亮藍 G－ 250法測定蛋白質(zhì)濃度 鄰苯二酚測定 PPO活性 將有活性管合并得 PPO純化液 II PPO純化液 II留 1/51/10體積 ， 4 ℃ 保存；余下樣品留待上第二個柱 上柱 打開層析柱下端液體出口 關(guān)閉下端液面出口 將 2ml左右濃縮 PPO初步純化液緩慢加到膠面 層析 打開下出液口， 待液面比膠面高 ，快速加洗滌液（平衡液），使液面比膠面約高 12cm 調(diào)節(jié)流速，使進液速度與出液速度一致 每 1管，收集 30ml 純化 III離子交換層析 柱材處理 DEAE－ 52干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡過夜，去掉懸浮的細微顆粒 N的 HCL溶液中浸泡 12 h，無離子水或蒸餾水洗至 pH值中性或 pH 4以上 N的 NaOH溶液中浸泡 1－ 2 h，無離子水或蒸餾水將其洗至中性。 平衡 TrisHCl緩沖液 （ 內(nèi)含 EDTA） 平衡 ， 保持液面比膠面高 12cm 裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加 1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通 將小燒杯中裝有適宜濃
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