【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 定順序）：接肽反應(yīng)需接肽試劑，為避免接肽試劑與某些活潑基團(tuán)反應(yīng)，故在接肽前須首先將這些基團(tuán)加以封閉或保護(hù)，如氨基保護(hù)或羧基保護(hù)等。在正常條件下，羧基和氨基之間不會(huì)自發(fā)形成肽鍵，即氨基或羧基需活化，通常是羧基活化。 固相肽合成：是控制合成技術(shù)的巨大進(jìn)步，利用固相肽合成儀已成功合成多種肽和蛋白質(zhì)。其實(shí)質(zhì)是肽的羧基端第一個(gè)氨基酸共價(jià)掛接在樹脂上，然后加入氨基受保護(hù)的第二個(gè)氨基酸并發(fā)生縮合反應(yīng)，形成肽鍵，依次類推。最后是肽與樹脂斷裂并去掉氨基端的保護(hù)基團(tuán)。 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力 非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵） 氫鍵 范德華力 疏水作用：突出地位 離子鍵（鹽鍵、靜電引力） 共價(jià)鍵：二硫鍵，重要作用 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 無規(guī)卷曲 β轉(zhuǎn)角 β折疊片 α螺旋：最常見、最典型、最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件 α螺旋： 是重復(fù)性結(jié)構(gòu)，每圈螺旋站 ，沿螺旋軸上升 ，即螺距值；由氫鍵封閉的環(huán)為 13元環(huán)；一般為右手螺旋； 分子內(nèi)或鏈內(nèi)氫鍵使之穩(wěn)定 ， 減少 R基間的相互作用或 β碳原子無分支結(jié)構(gòu)均利于其穩(wěn)定，而 Pro存在可中斷之。 (影響該結(jié)構(gòu)的因素課件） 非重復(fù)性結(jié)構(gòu) β折疊片 ：為重復(fù)性結(jié)構(gòu)； β折疊片的肽鏈處于曲折的伸展?fàn)顟B(tài)；借助鏈間或肽段間的氫鍵而穩(wěn)定；分為平行和反平行 β折疊片，平行的比反平行的更規(guī)則。 纖維狀蛋白質(zhì) 不溶性（硬蛋白） 可溶性蛋白 角蛋白 膠原蛋白：結(jié)締組織中（骨、皮膚等）大量存在 , 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 重復(fù)單元：GlyXPro(GlyXHyPro) 彈性蛋白：存在于結(jié)締組織 α角蛋白：主要存在于毛發(fā)中 (結(jié)構(gòu)特點(diǎn)） β角蛋白：天然存在于絲中 (結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（ GlyAla /SerGlyAla ） 肌球蛋白 血纖蛋白原 其它 說明： α角蛋白經(jīng)充分伸展后可轉(zhuǎn)變成 β角蛋白，即 β折疊片結(jié)構(gòu)。 無規(guī)卷曲：二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種結(jié)構(gòu)單元，在這種結(jié)構(gòu)單元的存在下，才使得蛋白質(zhì)形成球形，這一部分的存在往往與蛋白的活性有關(guān)。 無規(guī)卷曲與其他二級(jí)結(jié)構(gòu)一樣是明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 球狀蛋白質(zhì)： 其種類遠(yuǎn)比纖維狀蛋白質(zhì)多，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和功能的多樣性主要體現(xiàn)在球狀蛋白質(zhì)； 球狀蛋白質(zhì)的整個(gè)肽鏈沒有均一的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但具有多種二級(jí)結(jié)構(gòu)元件如 α螺旋、 β折疊片、無規(guī)卷曲等，由此構(gòu)建的三級(jí)結(jié)構(gòu) — 結(jié)構(gòu)域，并將球狀蛋白質(zhì)分成 4大類； 其三維結(jié)構(gòu)具有明顯的 折疊層次，且疏水測(cè)鏈球狀分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面； 在多數(shù)的胞內(nèi)酶、血漿蛋白及蛋白類激素都屬于球狀蛋白質(zhì)。 超二級(jí)結(jié)構(gòu)： 由若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組合在一起，彼此相互作用，形成種類不多，有規(guī)則的 二級(jí)結(jié)構(gòu)串，并在多種蛋白質(zhì)中充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。已知有 3種基本形式： αα、 βαβ、 ββ。 結(jié)構(gòu)域： 在多肽鏈上由二級(jí)結(jié)構(gòu)元件或超二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的相對(duì)獨(dú)立的 緊密球狀實(shí)體，是三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)。較小的球狀蛋白質(zhì)或亞基是單結(jié)構(gòu)域，而較大的球狀蛋白質(zhì)或亞基是多結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域可分 4類：全 α結(jié)構(gòu)、 α， β結(jié)構(gòu)、全 β結(jié)構(gòu)和富含金屬或二硫鍵結(jié)構(gòu)域。 蛋白質(zhì)變性與蛋白質(zhì)折疊 蛋白質(zhì)變性： 天然蛋白質(zhì)分子在受到理化因素的作用時(shí)導(dǎo)致溶解度降低、不對(duì)稱性增高、生物活性喪失及理化特性改變，此過程稱之為蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)變性的實(shí)質(zhì)是分子中次級(jí)鍵被破壞，引起天然構(gòu)象解體。變性不涉及共價(jià)鍵破壞，即蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)仍保持完好。當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)到天然構(gòu)象，此為蛋白質(zhì)的復(fù)性。是否蛋白質(zhì)變性與復(fù)性可逆，仍有疑問。 蛋白質(zhì)折疊： 蛋白質(zhì)折疊不是隨機(jī)的而是通過累積選擇找到自由能最低的構(gòu)象；折疊需要折疊酶和分子伴侶參加。 分子伴侶： 是一類與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)的蛋白質(zhì)家族（來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)，它們通過抑制新生肽鏈不正常的聚集并排除與其他蛋白質(zhì)不合理的結(jié)合而協(xié)助多肽鏈的正確折疊。 亞基締合與四級(jí)結(jié)構(gòu) ： 在同多聚體蛋白質(zhì)中，原體就是亞基，而在雜多聚體蛋白質(zhì)中，原體是由不同的亞基組成；亞基締合的驅(qū)動(dòng)力主要是疏水相互作用，亞基締合的專一性由相互作用的表面上的機(jī)性基團(tuán)之間的氫鍵和離子鍵決定。 Ⅳ 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 肌紅蛋白和血紅蛋白是兩個(gè)研究得最透徹的蛋白質(zhì)，它們是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的范例。肌紅蛋白是哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì)，它和血紅蛋白的亞基在氨基酸序列上具有明顯的同源性，它們的構(gòu)象和功能也十分相似。 肌紅蛋白 輔基血紅素：原卟啉 Ⅸ 與 Fe的絡(luò)合物稱血紅素。 卟啉化合物有很強(qiáng)的著色力，使生物組織呈現(xiàn)特定的顏色。卟啉環(huán)中心的鐵原子有 6個(gè)配位鍵，其中 4個(gè)與四吡咯環(huán)的 N原子相連，另 2個(gè)沿垂直于卟啉環(huán)面的軸分布在環(huán)面的上下。 鐵原子可以是亞鐵（ Fe2+）或高鐵 (Fe3+)，相應(yīng)的血紅素稱為亞鐵血紅素和高鐵血紅素，相應(yīng)的肌紅蛋白稱為亞鐵肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白。其中只有亞鐵態(tài)的蛋白質(zhì)才能結(jié)合 O2。 在肌紅蛋白分子中，血紅素共價(jià)地結(jié)合于肌紅蛋白分子的疏水空穴中。其中血紅素鐵在第 5配位鍵與珠蛋白第 93位 His殘基的咪唑 N配位結(jié)合；第 6配位鍵是O2的結(jié)合部位。血紅素的鐵原子如果處在水環(huán)境則容易被氧 化成 Fe3+，失去氧合能力，此時(shí) H2O分子代替 O2成為 Fe3+的第 6個(gè)配體。 CO能與 O2競(jìng)爭(zhēng)第 6配位鍵，且結(jié)合能力遠(yuǎn)大于 O2。 血紅蛋白（ Hb）的主要功能是在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)氧氣，它存在于紅細(xì)胞中。 Hb的結(jié)構(gòu)： 脊椎動(dòng)物的 Hb由 4個(gè)多肽鏈亞基組成，如成人的血紅蛋白主要是 HbA，亞基組成為 α2β2，次要組分是 HbA2，亞基組成為 α2δ2；每個(gè)血紅蛋白分子都有 4個(gè)血紅素，每個(gè)血紅素分別位于每個(gè)多肽鏈中的裂隙處，并暴露在分子的表面。 氧合過程中的構(gòu)象變化： 氧合作用顯著改變 Hb的四級(jí)結(jié)構(gòu)，且氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白具有不同的構(gòu)象。 氧合曲線和別構(gòu)效應(yīng)：氧合曲線呈 S形曲線（氧飽和度與氧分壓之間），即血紅蛋白的氧合具有正協(xié)同性同促效應(yīng)，一個(gè) O2的結(jié)合增加同一 Hb分子中其余空的氧合部位對(duì) O2的親合力； Hb對(duì) O2親和力的影響因素： H+、 CO2促進(jìn) O2從血紅蛋白中釋放， O2也促進(jìn) H+、CO2 在肺泡毛細(xì)血管中釋放； BPG（ 2， 3二磷酸甘油酸）降低 Hb對(duì) O2的親和力，其只與去氧血紅蛋白結(jié)合。 鐮刀狀細(xì)胞貧血病： 是一種 血紅蛋白分子病， 該病人的不正常的血紅蛋白稱 HbS，它只是在兩條 β鏈的 N端第 6位上 Glu被 Val置換。 這一改變使血紅蛋白表面產(chǎn)生一個(gè)疏水小區(qū)，導(dǎo)致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束，并引起紅細(xì)胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。 蛋白質(zhì)的分離純化 蛋白質(zhì)的分離和純化 :主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括蛋白質(zhì)分子的酸堿性質(zhì)、分子的大小和形狀、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)配體分子的特異親合力。 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)： 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團(tuán)主要來自側(cè)鏈上的功能團(tuán)，此外還有少數(shù)的末端 α羧基和 α氨基。 小肽的帶電性判斷 可以把蛋白質(zhì)分子看作是一個(gè)多價(jià)離子，所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量是由蛋白質(zhì)分子中的可解離基團(tuán)的種類和數(shù)目以及溶液的 pH所決定的。 對(duì)某一種蛋白質(zhì)來說，在某一 pH時(shí)，它所帶的 正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，這一 pH稱蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn) 。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在中性鹽存在下可發(fā)生明顯的變化，這是由于蛋白質(zhì)分子中的可解離基團(tuán)可與中性鹽中的陽離子或陰離子相結(jié)合。在沒有其他鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)的 質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的 pH稱為蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)。 蛋白質(zhì)分子的形狀： 測(cè)定蛋白質(zhì)分子的形狀或構(gòu)象，最精確的方法是 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析，但這種方法只能測(cè)定晶體狀態(tài)的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)。對(duì)于溶液中的蛋白質(zhì)分子的形狀，只能借助間接的方法來描述蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的輪廓。 測(cè)定蛋白質(zhì)分子相對(duì)質(zhì)量的方法 根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量：測(cè)定某一微量元素或某一氨基酸的含量如鐵原子或色氨酸，并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個(gè)鐵原子或一個(gè)色氨酸，即最低相對(duì)分子質(zhì)量 =鐵的原子量 /鐵的百分含量 滲透壓法：在半透膜存在時(shí)，蛋白質(zhì)溶液將產(chǎn)生滲透壓（平衡時(shí)的靜水壓力）。理想溶液的滲透壓與溶質(zhì)的濃度呈線性相關(guān)，滲透壓法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、且不受蛋白質(zhì)分子的形狀和水化程度影響，但受 pH的影響，不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一。 沉降法：離心力作用 沉降速率法：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)的沉降速度是個(gè)定值，稱沉降系數(shù) s。見 P296頁 沉降平衡法：沉降產(chǎn)生濃度梯度 凝膠過濾法：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知 Mr和斯托克半徑）和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球體），分子形狀為線型或與凝膠發(fā)生吸附的蛋白質(zhì)不可用此法測(cè)定。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：加入 SDS和少量巰基乙醇，則電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量，而與電荷和分子形狀無關(guān)。 蛋白質(zhì)沉淀法 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)溶液屬于膠體系統(tǒng)，其具備形成膠體系的條件：分散相（蛋白質(zhì)分子顆粒）的質(zhì)點(diǎn)大小在 1~100nm，能在分散介質(zhì)中作布朗運(yùn)動(dòng)；分散相的質(zhì)點(diǎn)帶同種電荷，不易凝聚成大顆粒而沉淀；分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層如水化層而不易凝聚。 蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。如果條件改變，則蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來，如改變質(zhì)點(diǎn)大小、電荷或水化層等。沉淀蛋白質(zhì)的方法如下： 鹽析法：加入大量的中性鹽，脫去水化層而沉淀 有機(jī)溶劑沉淀法：加入極性的有機(jī)溶劑如甲醇等，脫去水化層并增加質(zhì)點(diǎn)間的相互作用而沉淀 重金屬鹽沉淀法：當(dāng) pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶凈負(fù)電荷，易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀 生物堿或酸類沉淀法：當(dāng) pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶凈正電荷，易與生物堿或酸根負(fù)離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀 加熱變性沉淀法：蛋白質(zhì)因加熱變性而凝固 蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度，即設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)以增加單位蛋白質(zhì)重量中所需蛋白質(zhì)的含量或生物活性。分離純化蛋白質(zhì)的程序?yàn)椋呵疤幚恚?xì)胞或組織處理）、粗分級(jí)分離（除去雜蛋白）和細(xì)分級(jí)分離。 蛋白質(zhì)的分離純化方法 分子大小 透析和超濾 ：透析指利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。 密度梯度離心 ：蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。 凝膠過濾 ：即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱，分子小的后流出 。 溶解度 等電點(diǎn)沉淀和 pH控制 鹽溶和鹽析 ：中性鹽在低濃度時(shí)可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時(shí)，此時(shí)與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。 有機(jī)溶劑分級(jí)分離法 ：一是降低介質(zhì)的介電常數(shù)，二是與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水。 溫度沉淀 ：溫度對(duì)溶解度有影響，低溫穩(wěn)定，高溫不穩(wěn)定。在 0~40℃ ，大部分的球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增加。 蛋白質(zhì)分離純化方法 電荷 電泳 （凈電荷、分子大小、形狀） 區(qū)帶電泳 聚丙烯酰氨凝膠電泳（ PAGE） 毛細(xì)管電泳 離子交換層析：相應(yīng)的離子交換膠， CM陽離子， DEAE陰離子 等電聚焦 ：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有 pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的 pH處，形成區(qū)帶。 層析聚焦 ：層析柱中建立連續(xù)的 pH梯度，蛋白質(zhì)樣品由柱上端隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點(diǎn) pH處，形成區(qū)段。 吸附 ： 吸附層析，吸附劑（硅石、氧化鋁、活性碳）和疏水吸附劑，與待分離分子和雜質(zhì)分子的吸附與解吸能力不同。 特異親和力：親和層析 其它：如高效液相層析（ HPLC） , 快速蛋白液相層析（ FPLC） 蛋白質(zhì)純度的鑒定方法 ： 采用物理化學(xué)方法如電泳、離心沉降、 HPLC和溶解度分析等。純的蛋白質(zhì)電泳時(shí)，其電泳圖譜只呈現(xiàn)一個(gè)條帶或峰，離心時(shí)以單一的沉降速度移動(dòng)；純的蛋白質(zhì)在一定的溶劑系統(tǒng)中具有恒定的溶解度，即溶解度曲線只有一個(gè)折點(diǎn)，在折點(diǎn)以前直線斜率為 1，在折點(diǎn)以后斜率為零 ； 此外，N末端分析也用于純度鑒定（單體蛋白質(zhì)而言）。 必須指出，采用任何單獨(dú)的一種方法鑒定純度只能作為蛋白質(zhì)均一性的必要條件而非充分條件，即蛋白質(zhì)往往在一種鑒定中表現(xiàn)為均一性，而在另一種鑒定中又表現(xiàn)為不均一性。 蛋白質(zhì)含量測(cè)定與純度鑒定： 測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法有：凱氏定氮法、雙縮脲法、 Folin酚試劑法（ Lowry法，標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法） 、紫外吸收法、染料（考馬斯亮藍(lán)）結(jié)合法、膠體金法（帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高）