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正文內(nèi)容

感受態(tài)細(xì)胞的制備與連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株(編輯修改稿)

2025-05-27 23:22 本頁(yè)面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 一個(gè)非常有用的嚴(yán)緊型宿主菌。 BL21是應(yīng)用最廣的宿主菌來(lái)源,具有 lon和 ompT蛋白酶缺陷的優(yōu)點(diǎn) . ( DE3)宿主菌是 lDE3溶原菌,染色體上帶有一拷貝由 lacUV5啟動(dòng)子控制的 T7 RNA聚合酶基因。這類菌株配合 pET載體一起表達(dá)。 pLysS是帶有可以與 pET共存的、編碼 T7溶菌酶( T7 RNA聚合酶的天然抑制物)的質(zhì)粒。 pLysS 菌株在被誘導(dǎo)前 T7 RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)被抑制,這樣可以使表達(dá)會(huì)影響宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有 pLacI質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制 pETBlue和 pTriEx載體基礎(chǔ)表達(dá)的 lac阻遏蛋白。 Inductive Expression Introduction LacI pETBlue 大腸桿菌基因組 Lac啟動(dòng)子 T7啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo) IPTG誘導(dǎo) 大腸桿菌 RNA聚合酶 T7 RNA聚合酶基因 1 T7RNA聚合酶 T7RNA聚合酶 靶基因 pETBlue系統(tǒng)調(diào)控元件 LacI Lac阻遏物 Lac阻遏物 DE3 LacO LacO pLacI TunerTMDE3LacI Inductive Expression Introduction Xgal: 5溴 4氫 3吲哚 β D半乳糖苷 Xgal(無(wú)色) 深藍(lán)色 β半乳糖苷酶 Α互補(bǔ): ω片段(無(wú)活性,宿主) + α片段(無(wú)活性,載體) β半乳糖苷酶(活性) 無(wú)菌 冰浴 輕柔 制備感受態(tài)細(xì)胞 預(yù) 培 養(yǎng) : (昨天下午 ) LB培養(yǎng)基 ( 4mL,含 ) 37 ℃ 、 190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜 擴(kuò) 大 培 養(yǎng) : (今天早晨 ) + 40mL LB液體培養(yǎng)基( 含 ) 37 ℃ 、 250rpm振蕩培養(yǎng) NovaBlue 收集細(xì)胞: 終
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