【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 為 濾液 （ Filtrate）。 （ 1）過濾介質(zhì)（ Filter medium）： 過濾介質(zhì)應(yīng)具有以下特性：多孔性，足夠的機(jī)械強(qiáng)度，盡可能小的流動(dòng)阻力，耐腐蝕性，耐熱性，易于再生。 工業(yè)上常見的過濾介質(zhì)：織物介質(zhì)、堆積介質(zhì)、多孔固體介質(zhì)、多孔膜。 （ 2）過濾分類： 深層過濾、濾餅過濾 （ 3）過濾推動(dòng)力：重力（漏斗過濾）、壓力（加壓過濾）或真空（抽濾）、離心力（離心過濾）。 （ 4）濾餅的可壓縮性 （ 5）助濾劑：助濾劑本身就是一性能良好的過濾介質(zhì)，是一種堅(jiān)硬、不規(guī)則的小顆粒，它能形成結(jié)構(gòu)疏松、 空隙率大、不可壓縮的濾餅，很大程度改善過濾難度。助濾劑使用方法主要有兩種：混合、預(yù)涂。 過濾速度 過濾過程數(shù)學(xué)描述 達(dá)西方程： 適用于不可壓縮和簡(jiǎn)單的可壓縮濾餅 普遍使用于生物分離過程 過濾基礎(chǔ)理論 。 Darcy 定理 U = 流體的速度 (in: m/s)， ?p = 壓力差 (in: Pa)， l = 床層厚度 (in: m)， K = Darcy’s 滲透系數(shù)，與流體和床層的性質(zhì)有關(guān) 。 Kozeny’ s 方程 對(duì)于發(fā)酵液的過濾 ,要用 Kozeny’ s 方程 K’’ = Kozeny’s 常數(shù)，一般 K’’ = 5（在大量均勻的球形顆粒中），其他顆粒 K’’ = ，顆粒 ?， K’’ ?； S = 單位體積顆粒中顆粒的表面積； ? = 發(fā)酵液黏度 (in: Pa s)； ? = 床層的空隙率，即空隙體積與總體積的比值。 方程適應(yīng)條件： A、薄層區(qū)域表面的流速， B、非常高的孔隙率， C、非常廣的顆粒尺寸的分布， D、纖維狀的、可壓縮的和吸濕性的填充物。 意義：過濾的基礎(chǔ)方程，揭示了過濾流速與各因素的關(guān)系 過濾速度： 濾餅阻力與濾餅干重之間的關(guān)系 : α 為濾餅的平均比阻，不可壓縮性濾餅的α為常數(shù)，可壓縮性濾餅的α為壓差的函數(shù)，經(jīng)驗(yàn)表達(dá)式為： 比阻 (平均質(zhì)量比阻 m/kg)定義式 S = 單位體積顆粒中顆粒的表面積 ?s：干濾餅的密度 (in kg/m3)。 意義： A、反映過濾的難易程度，越大，越困難； B、與顆粒大小、孔隙率等的關(guān)系。 n 濾餅可壓縮度，當(dāng)濾餅不可壓縮時(shí)， n = 0；對(duì)于高度可壓縮濾餅，則 n ? 1。 ? = 濕濾餅的質(zhì)量：干濾餅的質(zhì)量。 意義： A、對(duì)于可壓縮料液，高壓不一定增加流量 B、比阻與壓力的關(guān)系 隨著過濾操作的進(jìn)行，濾餅量不斷增加，與濾液體積 Q 之間關(guān)系如下： β =濕濾餅 /干濾餅； cs=干濾餅 /液料 β cs=濕濾餅 /液料； 1 β cs= 濾液 /液料； Q 濾液體積 Q/（ 1 β cs） = 液料體積 ρ LQ/ （ 1 β cs） = 液料質(zhì)量 所以 Ruth’s 方程 在過濾操作中，被截留的固相顆粒在介質(zhì)形成濾餅。過濾的阻力來自過濾介質(zhì)和濾餅。過濾流量可表達(dá)為 Q：濾液體積 (in m3)， A：過濾面積 (in m2)， ? ＝ 濕濾餅 :干濾餅， cs：料液中干固相成分的濃度 (in: kg/kg)， ?Ｌ：濾液密度， Q0：相當(dāng)于過濾介質(zhì)阻力時(shí)的虛擬濾液體積 (in m3)，一定過濾介質(zhì)的 Q0 為常數(shù)。 意義：過濾的流量方程 恒壓過濾方程 (最常用模式 ) 恒壓條件下對(duì) Ruth’s 方程積分： t0：為透過虛擬體積所要的虛擬時(shí)間。在一般條件下 Q0 可忽略，上式為： 意義：中試后放大的理論依據(jù) 恒速過濾 恒速條件下對(duì) Ruth’s 方程積分 ： 過濾設(shè)備 過濾設(shè)備從傳統(tǒng)的板框式過濾機(jī)到旋轉(zhuǎn)式真空過濾設(shè)備，種類很多。 常用新型過濾器： 轉(zhuǎn)鼓真空過濾器 應(yīng)用：大規(guī)模生物分離的主要過濾設(shè)備，用于較難分離的低黏度發(fā)酵液 優(yōu)點(diǎn)：Ａ、大規(guī)模，Ｂ、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，Ｃ、濾布裝卸容易、易保養(yǎng)維護(hù)。 缺點(diǎn)：Ａ、占地大，單位體積利用率低，Ｂ、周期性中斷進(jìn)料、濾布利用率 低，Ｃ、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵。 圓盤真空過濾器 應(yīng)用：同上。 優(yōu)點(diǎn)：Ａ、超大規(guī)模 (400 m2)，極易實(shí)行大型化分離，Ｂ、占地小，單位體積利用率高，Ｃ、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單。 缺點(diǎn)：Ａ、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵液， B、設(shè)備投資高。 帶式真空過濾器 應(yīng)用：大規(guī)模分離的主要過濾設(shè)備，可分離較難分離的低黏度的發(fā)酵液，對(duì)濾餅洗滌要求高。 優(yōu)點(diǎn)：Ａ )、發(fā)酵液處理量大，濾餅厚達(dá) 200mm， Ｂ )、濾餅洗滌容易，效果好，無(wú)須攪拌， Ｃ )、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，清洗保養(yǎng)容易。 缺點(diǎn)：Ａ )、占地大，有效過 濾面積低， Ｂ )、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵液， Ｃ )、設(shè)備投資高。 壓力系列： 帶式 、板框、加壓、氣壓罐式壓濾機(jī) 應(yīng)用：用于很難處理的、高黏度、高細(xì)顆粒含量的發(fā)酵液的固液分離。 優(yōu)點(diǎn)：Ａ、操作壓高０ .１ Mpa 以上， １０％的 顆粒含量，高含量的細(xì)顆粒， Ｂ、濾餅含水量低，濾液澄清， Ｃ、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，清洗保養(yǎng)容易。 缺點(diǎn)：Ａ、占地大，有效過濾面積低，Ｂ、設(shè)備投資高，能耗高。 如何選擇過濾器？ 濾液的澄清度 顆粒大小的分布 發(fā)酵液的黏度 固體顆 粒的濃度 濾餅的干燥度 濾餅的洗滌 生產(chǎn)能力 中試實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的路線 ： 確定生產(chǎn)能力（例： 150T/d） 確定中試實(shí)驗(yàn)的規(guī)模（一般按生產(chǎn)能力縮小 100 倍，即 150/100 = ） 測(cè)定重要參數(shù)，如 ?， Q0 等 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件 確定不同的實(shí)驗(yàn)條件：預(yù)處理、助濾劑、壓力等 濾餅的厚度與時(shí)間關(guān)系 濾餅的孔隙率與壓力關(guān)系 不同壓力下濾液的體積與時(shí)間的關(guān)系 濾餅的洗滌、脫水、排脫等 濾液的澄清度，以及上述方程要求的數(shù)據(jù)利用方程等 計(jì)算： A、過濾面積 A，確定型號(hào) (以恒壓為例 ) 放大 100 倍 生產(chǎn)能力 (= 100A) 結(jié)論： 離心和過濾是去除不溶物的主要方法，生物分離工業(yè)首先要去除不溶物，大的、硬的不溶物可用過濾方法去除， 對(duì)于大部分發(fā)酵液，助濾劑或者其它預(yù)處理方法有利于過濾，但也有沒有效果的。另外一些小的、難過濾的固體顆?？捎秒x心分離。 細(xì)胞破碎 胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細(xì)胞代謝物 細(xì)胞本身： 單細(xì)胞蛋白（ SCP） 胞內(nèi)產(chǎn)品 :堿性磷酸酯酶，基因工程產(chǎn)物，植物細(xì)胞產(chǎn)物等 2 . 細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 細(xì)胞壁的組 成和破碎阻力 細(xì)菌 ：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 酵母菌： 葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度。 真菌： 多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理 物理法 化學(xué)法 固體剪切法 (珠磨法 ) 酶溶法 液體剪切法 化學(xué)降解法（酸堿法） 撞擊法 表面活性劑法 超聲法 有機(jī)溶劑膨脹法 滲透法 萃取法 細(xì)胞破碎理論 1)、細(xì)胞破碎 A 壓撞 B 剪切 Ca 滲透 Cb 凍脹 D 破壁破膜 2)、產(chǎn)物釋放 細(xì)胞破碎技術(shù) 機(jī)械破碎 ： 主要有高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等方法 1)、固體剪切法 (珠磨法 , c 最有效的物理破碎法 ) 影響因素： a) 轉(zhuǎn)盤外緣速度 b) 珠粒添量和大小 c) 溫度：溫度在 540?C 范圍內(nèi)對(duì)破碎影響較小。但研磨產(chǎn)熱，功率 ? ，溫度 ? 。如產(chǎn)物熱不穩(wěn)定，必須控溫。 d) 細(xì)胞濃度 x：最佳 x 由實(shí)驗(yàn)確定。一般產(chǎn)熱量隨細(xì)胞濃度的降低而下降，但單位細(xì)胞重量的能耗 ? 。通常懸液中細(xì)菌細(xì)胞質(zhì) 量濃度在 60120g/L、酵母細(xì)胞質(zhì)量濃度在 14010g/L 時(shí)破碎效果較理想 e) 破碎效率： f) 流量 Q：破碎為一級(jí)反應(yīng)。 Q?, E?， R?； Q?， E?， R?。 2)、液體剪切法 (最常用的方法之一 ) 影響因素： 操作壓力 p： p?, R? 。相反 , R? 。溫度 ? 2?C /10MPa 。 破碎次數(shù) N： N?， R ?。 溫度：比速度 k 與溫度有關(guān)，溫度 ?25?C， k? 倍。 細(xì)胞抗破碎系數(shù) a： a 酵母 =， a 大腸桿菌 = 。 細(xì)胞種類：影響 k 值。 細(xì)胞濃度： 優(yōu)點(diǎn)： A、在大規(guī)模 cell 破碎中 ，高壓勻漿機(jī)和珠磨機(jī)用得最多 。 B、高壓勻漿機(jī)最適合于酵母和細(xì)菌 。 C、珠磨機(jī)可用于酵母和細(xì)菌，但對(duì)真菌菌絲和藻類更合適 . 3) 撞擊破碎法 優(yōu)點(diǎn)： A、細(xì)胞破碎僅發(fā)生在撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免反復(fù)和過度破碎； B、破碎的程度可無(wú)級(jí)調(diào)節(jié)，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，特別適合于細(xì)胞器的回收； C、實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模均可應(yīng)用。 4) 超聲破碎法 (15—25kHz) ? 超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的 1525kHz 的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 ? 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成 ，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為 槽式 和 探頭直接插入介質(zhì) 兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。 機(jī)理：在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用 (cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。 優(yōu)點(diǎn)：適合于多種細(xì)胞的破碎 缺點(diǎn)： A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀； B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用； C、有效能量的利用率低； D、產(chǎn)熱大，需控溫； E、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。 化學(xué)破碎法 酶溶法、酸 堿法、有機(jī)溶劑胞溶法、表面活性劑法 酶溶法：利用酶分解細(xì)胞壁上特出的化學(xué)鍵，使細(xì)胞壁破碎。 優(yōu)點(diǎn)： A、產(chǎn)品釋放的選擇性； B、提取速度和收效高； C、產(chǎn)品的破壞?。? D、對(duì)外界環(huán)境，如 pH 和溫度等要求低； E、不殘留細(xì)胞碎片。 酶解（酶溶法 Enymatic lysis) ? 利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（ lysozyme)適用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以 EDTA 使之更有效地作用于細(xì)胞壁。 ? 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。 ? 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過程繼續(xù)下去?？墒?，改變其生長(zhǎng)環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。 ? 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用 6mol/L HCl。堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等 ? 合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型 如十二烷基硫酸鈉（ SDS，陰離子型）；十六烷基三甲基溴化銨（陽(yáng)離子型）。非離子型如 Triton X100 和吐溫（ Tween）等 ? 有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 物理滲透法 滲透壓沖擊法 ? 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 凍結(jié) 融化法 ? 將 細(xì)胞放在低溫下冷凍（約 15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。 機(jī)械法和化學(xué)法的比較 機(jī)械破碎法缺點(diǎn)： A、高能、高溫、高噪音、高剪切力 (四高 )，易使產(chǎn)品變性失活； B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難； C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。 化學(xué)破碎法缺點(diǎn)： A、費(fèi)用高； B、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法； C、一般只有有限的破碎， 常需與其他物理法連用。 破碎方法的選擇 選擇的一般原則： A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎 B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法 C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法 破碎技術(shù)雜交研究應(yīng)注意的問題： A、雜交技術(shù)可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)。 B、破碎技術(shù)對(duì)下游分離技術(shù)的影響。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化 C、在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度的影響 D、菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物 ? 胞外產(chǎn)物 細(xì)胞破碎的評(píng)價(jià) 直接計(jì)數(shù)法 方法：樣本稀釋 染色 上樣 計(jì)數(shù)。 計(jì)算：同上。 優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單。 缺點(diǎn)： A、計(jì)數(shù)時(shí)間長(zhǎng)， B、只有活細(xì)胞才被計(jì)