【文章內容簡介】 am功能：蛋白產物和寄主細胞的外切核酸酶 Ⅴ （ 宿主 recB和 recC基因產物 ） 結合成復合物 ，失去對 λDNA的作用活性 ， 因而 λ噬菌體能夠合成成熟的多聯(lián)體 DNA， 供作包裝底物 ? 基因 red功能：參與裂解性生長早期發(fā)生的重組反應 ， 是核酸外切酶 ， 使 θ型復制中的病毒 DNA分離形成子代閉環(huán) DNA分子 ? recA＋ 的 P2溶原菌 ? redgam ：利用大腸桿菌的重組酶（ recA＋ ） ， 通過單體 λDNA間的重組作用 ， 產生出成熟的多聯(lián)體 λDNA以進行包裝 ， 大腸桿菌的重組系統(tǒng)依賴于 recA基因 。 ? chi位點的引入 ? red和 gam基因缺失 (red和 gam)的 λ噬菌體在 P2溶源菌或野生型大腸桿菌中生長較差 ， 形成的噬斑很少 ，然而當在 λDNA中引人 chi位點后 ， Spi噬菌體在宿主菌中的繁殖力便會隨之增強 ， 噬斑變大 。 ? chi位點 （ 交換熱點激活區(qū) ） 由一段長度為八核苷酸的 DNA序列組成 ， 其序列為 5’ GCTGGTCG 3’。 野生型 λDNA中并無此序列 ， 但在大腸桿菌染色體DNA和真核基因組中都存在有 chi序列 ， 大腸桿菌DNA平均每 5000bp出現(xiàn)一次 chi序列 。 ? chi位點：與重組事件有關聯(lián)的 DNA序列 ，激活以 rec為媒介的交換反應 ， 是 recB、 C系統(tǒng)催化重組作用的底物 。 但 RecB、 C重組酶的活性可被基因 gam的產物所抑制 。 因此對于 red、 gam突變體或因外源 DNA的插入而呈 Spi表型的重組體而言 ， chi位點的引人會使噬菌體生長繁殖力變強 ， 噬斑增大 。 四 、 體外包裝 λ重組體 DNA分子的轉染作用 ? λ噬菌體 DNA體外重組后 ， 一般必須經過體外包裝 ， 然后以 噬菌體感染 （ 轉導 ） 的方式將重組 DNA導入 。 ? 因 為 以 感 染 方 式 導 入 細 胞 的 頻 率 可 達106~108/μgDNA， 而以 轉染 （ translation） 的方式導入的頻率僅為 103~104/ μgDNA。 ? 體外包裝：把重組體 DNA分子包裝成成熟的噬菌體顆粒 ， 從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導入宿主細胞 ， 可以提高轉染效率 ， 可達 107左右 。 λ重組體 DNA的體外包裝 ? 在 A蛋白 （ 有終止復制功能 ） ，E蛋白 （ 是包裝蛋白 ） ， D蛋白（ 是插入蛋白 ）共同作用下使重組體 DNA 轉入頭部 。 主要外殼蛋白是基因 E的產物 基因 A的產物在 cos位點切割后進入頭部 包含在外殼中基因 D的產物 基因 W和 FⅡ的產物組裝成完整的尾部 ? λ重組體 DNA的體外包裝： 在體外試管中完成上述反應 ， 利用 D基因突變和 E基因突變 。 ? E基因琥珀突變 （ Eam） 不能形成任何頭部 ，積累大量的尾部 ? D基因琥珀突變 （ Dam） ， λ重組體 DNA不能進入頭部 ， 成熟作用在頭部前體階段被終止 ， 因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累 。 ? 使用具有 cⅠ 857突變基因的 λ噬菌體的溶源大腸桿菌： BHB2690 （ Dam ） 和 BHB2685（ Eam） 菌株培養(yǎng)獲得頭部和尾部 ? cⅠ 857是溫度敏感性阻遏基因 ， 32℃ 為溶源狀態(tài) ， 44～ 45℃ 誘發(fā) ， 溶菌的 S基因突變 ， 因而不會溶菌 。 ? 大量收集頭部尾部蛋白 ， 在體外與重組λDNA包裝 ?由于 λ噬菌體包裝時 ， 當 DNA的長度短于 野生型的 75%或超過 105%時 ， 噬菌體的活性就急劇下降 。 因此只包裝它的野生型 DNA（ 48KB） 的 75%～ 105%左右的ＤＮＡ ， 要求 λ載體 DNA和外源 DNA長度上限是 51kb，必需基因為 28kb， 外源極限在 23kb。 λ噬菌體的包裝限制 ? 計算包裝范圍（ KB） ? 48 75%＝ 36 ? 48 105%＝ 51 ? 必需基因為 28 ? 包裝范圍 8kb～ 23kb ? 《 分子克隆試驗指南 》 78%～ 105%，包裝范圍在 10～ 23kb λ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價值的克隆載體 ， 具有很多優(yōu)點： ① 其分子遺傳學背景十分清楚； ② 載體容量較大 ， 一般質粒載體只能容納 10多個 kb ， 而 λ噬菌體載體卻能容納大約 23kb的外源 DNA 片段； ? 由于 λ噬菌體頭部組裝時容納 DNA 的量是固定的 ，因此插入外源 DNA 長度必須控制在使重組 DNA 為野生型 λ DNA 長度的 75%~105% 之間 ， 否則難以正常組裝 。 ③ 具有較高的感染效率 ， 其感染宿主細胞的效率幾乎可達 100% ， 而質粒 DNA的轉化率卻只 % 。 back 第三節(jié) 柯斯質粒載體（ Cosmid vector ） ? 1978年 ， J. collins和 B. Hohn等人發(fā)展出的一種人工載體 ? 帶有 cos位點的質粒載體 ? 46kb， 帶有選擇標記 ， 在構建 cDNA文庫中很有用 。 ? 可攜帶大的外源 DNA片段 ， 克隆 45kb基因 。 一 、 柯斯質粒載體的構建 ? cosmid載體：也稱粘粒 、 柯斯載體 。 這是一類用于克隆大片段 DNA的載體 ， 它是由 λ噬菌體的 cos（ cohesive） 末端 及 質粒 （ plasmid）重組而成的載體 。 ? cosmid載體帶有質粒的復制起點 、 克隆位點 、 選擇性標記 ? λ噬菌體用于包裝的 cos末端等 ， 因此該載體在體外重組后 ， 可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝 ， 利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導入受體細胞 。 但它不會產生子代噬菌體 ， 而是以質粒 DNA的形式存在于細胞內 。 柯斯質粒 pHC79系由質粒pBR322 和噬菌體 λ的 cos位點的一段 DNA 構成全長 ， 克隆 能 力 為 31 ～45kb， 能夠被包裝成具有感染性能的噬菌體 二 、 柯斯質粒載體的特點 具有 λ噬菌體的特性； ? 插入合適長度外源基因后 ， 可以在體外被包裝成噬菌體 ， 可以高效的感染大腸桿菌 ， 進入細胞后環(huán)化 ， 并且不形成子代噬菌體 具有質粒載體的特性； ? 含有質粒復制子 ，進入寄主后可以象質粒一樣復制 ， ? 抗菌素抗性標記可以進行篩選 具有較高容量的克隆能力； ? 分子量較小 ， 一般 46kb， 因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達到 45kb ? 最低極限 ， 如果柯斯質粒有 5kb， 外源必需要至少 30kb 具有與同源性序列的質粒進行重組的能力 ? 在同一個宿主中的柯斯質粒和質粒會形成共合體 。 三、柯斯克隆 ? 柯 斯 克 隆 （ cosmind cloning） ： 在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組 DNA的技術 ? 依據(jù)原理 : λ噬菌體在生命周期可以產生數(shù)百個由 cos位點連接的多連體分子 ? 末端酶 （ Ter體系 ） ：能識別兩個相距適宜的cos位點 ， 將多聯(lián)體切割成單位長度的片段 ，并包裝至頭部 ， 作用有效范圍 ， 兩個 cos之間相距 38～ 54kb。 Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone 四、柯斯克隆的改良 ? 優(yōu)點