噬菌體載體和柯斯載體(已修改)
2025-05-11 05:34 本頁面
【正文】 第五章 噬菌體載體和柯斯載體 本章主要內(nèi)容 ? 噬菌體一般特性 ? λ噬菌體 ? 柯斯質(zhì)粒 ? M13噬菌體 M13噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu) M13噬菌體載體類型及特點(diǎn) 噬菌粒 比較 第一節(jié) 噬菌體的一般生物學(xué)特性（ Bacteriophage， phage） ? 噬菌體可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持生命 ，但一旦脫離了寄主細(xì)胞 ，就不能生長和復(fù)制 ? 利用寄主的核糖體 、 蛋白質(zhì)合成因子 、 氨基酸和產(chǎn)能體系 ， 進(jìn)行生長和繁殖 ? 可脫離寄主細(xì)胞生存 ， 但不能進(jìn)行復(fù)制 。 ? 除了對寄主的依賴性 ， 還具備其它的功能： 保護(hù)自己的核苷酸分子 （ DNA、 RNA） 免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞； 將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞； 將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系 ， 從而生長出大量的子代噬菌體顆粒； 使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒 一、 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型 結(jié)構(gòu)： 無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性 DNA、 雙鏈環(huán)形 DNA、 單鏈環(huán)形 DNA、 單鏈線形 DNA、 單鏈 RNA。 ? 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的 。 大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對寄主的依賴性較低 ? 有些噬菌體的 DNA 堿 基 不 是 由 標(biāo) 準(zhǔn) 的A/T/C/G組成的 。 Example： T4噬菌體 DNA沒有 C堿基 ， 取代的是 5羥甲基胞嘧啶 （ HMC） ； SP01噬菌體 DNA中沒有 T堿基 ，取代的是 5羥甲基尿嘧啶 （ HMU） 。 二、噬菌體的感染性 噬菌斑形成 噬菌體 感染高濃度細(xì)菌 在未發(fā)生第一次裂解前涂布平板 ? 噬菌體的感染過程 尾部粘至細(xì)胞壁 尾部蛋白質(zhì)收縮 核酸注入細(xì)菌 利用細(xì)菌的 RNA聚合酶和核糖體翻譯得到噬菌體蛋白 使細(xì)菌的 DNA降解 合成自身的 DNA至數(shù)百個(gè)拷貝 合成頭部尾部蛋白進(jìn)行組裝 三 、 噬菌體的溶菌生命周期 ? 噬菌體的生命周期分為 溶菌周期 和 溶源周期 ? 只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體 。 ? 烈性噬菌體溶菌生長的基本過程： 吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上 注入 噬菌體 DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞 轉(zhuǎn)變 被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場所 合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì) 組裝 包裝了 DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒 釋放 子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來 四 、 噬菌體的溶源生命周期 ? 溶源生長周期：是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒 ， 噬菌體的 DNA是整 合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上 ， 成為它的一個(gè)組成部分 。 ? 現(xiàn)知道只有 雙鏈 DNA的噬菌體 才具有溶源周期 概念 ? 溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶源生命周期 。 ? 溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌 ? 溶源化：用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過程 ? 整合：噬菌體的 DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體 DNA中 ? 原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體 ? 超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染 。 溶源周期的主要特征 ? λ噬菌體和 P1噬菌體 ? λ噬菌體的特征： (1) 噬菌體的 DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞 (2) 經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后 ， 需要合成一種 整合酶 ， 于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉 (3) 噬菌體的 DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組 DNA上 ， 變成原噬菌體 (4) 細(xì)菌繼續(xù)生長 、 增值 ， 噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制 。 ? 噬菌體 P1基本特征： 不存在噬菌體 DNA分子的整合作用體系 ， 而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒DNA分子 。 超感染免疫性 （ 1） 溶源細(xì)菌的兩個(gè)重要特點(diǎn)： ? 不能被頭一次感染的噬菌體再次感染 ， 稱為超感染免疫性 ； ? 經(jīng)過許多世代以后 ， 溶源性細(xì)菌可以進(jìn)入溶菌周期 ， 稱為 溶源性誘發(fā) 。 ① 超敏感免疫性 ? 阻遏－操縱體系： cⅠ 基因編碼阻遏蛋白 ， 啟動子 PL和 PR， 操縱基因 OL和 OR OL PL cⅠ PR OR ? 阻遏蛋白同操縱基因結(jié)合使 RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄 ， 這種狀態(tài)有充分的能力使原噬菌體保持 “ 關(guān)閉 ” 形式 ， 溶源細(xì)菌能夠正常生長 。 ② 溶源噬菌體的誘發(fā) ? 依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用 。阻遏物被一種蛋白酶切割 ， 失活 ， 使噬菌體轉(zhuǎn)錄 。 ? 需要 刪除酶 將噬菌體的 DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來 ， 使之形成環(huán)形的 DNA分子 ， 恢復(fù)溶源周期開始時(shí)的狀態(tài) 。 整合酶必須首先與 宿主編碼 的 宿主整合因子 (host integration factor， Hif)結(jié)合形成復(fù)合體，才能催化 attP和 attB在 O區(qū)進(jìn)行重組而形成原噬菌體。 Hif 五、重組噬菌體的分離 ?大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期 ? 加入 λ噬菌體懸浮液 ， 37℃ 培養(yǎng) 1小時(shí) ? 用新鮮培養(yǎng)稀釋 ， 繼續(xù)培養(yǎng) 412小時(shí) ? 高速離心 ， 沉淀噬菌體 ? 苯酚抽提 ， 釋放 λDNA ? 乙醇或異丙醇沉淀 DNA。 back λ噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu) λ噬菌體載體類型及特點(diǎn) 第二節(jié) λ噬菌體載體 back ?λ 噬菌體分子量31 106dal， 中等大小的溫和噬菌體 ， 目前已經(jīng)定位 61個(gè)基因 ，其中一半?yún)⑴c了生命周期 ， 為 必要基因；余下的為非必要基因 。 溶菌階段 (復(fù)制和釋放 ) 溶源階段 (整合寄主染色體 ) λ phage 一 、 λ噬菌體的分子生物學(xué)概述 基因組結(jié)構(gòu) （ 1） cos位點(diǎn) ? 線性雙鏈 DNA分子兩端各有一條 12nt組成的彼此完全互補(bǔ)的 5’突出單鏈 ? 注入宿主后 ， 粘性末端互補(bǔ)形成雙鏈區(qū) ， 成為 cos位點(diǎn) 。 cos位點(diǎn)的兩個(gè)作用： ? 使進(jìn)入細(xì)菌的 DNA分子成為環(huán)狀 ， 這是插入細(xì)菌基因組的先決條件 。 ? 作為識別位點(diǎn) ， 由內(nèi)切酶將滾環(huán)復(fù)制的多聯(lián)體 DNA切開 5‘CGGGGCGGCGACCTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGGAGC5’ Cleavage Ligation (during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG3’ 5’CG + GC
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