【文章內(nèi)容簡介】 中，蒸餾水中可適當(dāng)添加 %MgSO %KH2PO4 及 %(NH4)2HPO4，避免水質(zhì)波動對孢子質(zhì)量的影響，還可以縮短 孢子的成熟期。 種子制備 種子制備是指孢子接入種子罐后 ，在罐中繁殖成大量菌絲的過程，其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。種子制備所使用的培養(yǎng)基及其它工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。 種子培養(yǎng)基的成分基本與發(fā)酵培養(yǎng)基近似，培養(yǎng) 30℃ 、 30 小時左右培養(yǎng)液趨于濃厚并轉(zhuǎn)為黃色。 pH 一般在 時可以移入下一級罐。移入發(fā)酵罐時 pH，效價在800u/ml 左右。 種子罐級數(shù)是在指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。土霉素種子制備一般為二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基介紹 培養(yǎng)基是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 11 的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量等。土霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機(jī)鹽及金屬離子、添加前體、消泡劑五部分組成。 碳源的主要作用是：為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分。 生產(chǎn)上曾以單糖 — 葡萄糖、雙糖 —飴糖、及多糖 — 秈米粉、玉米粉及淀粉的解酶液作為碳源。 本設(shè)計采用淀粉作為碳源，發(fā)酵相對容易控制。 氮 源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸的原料。主要有機(jī)氮源為 黃豆粉餅、花生粉餅、蛋白胨、酵母粉、玉米漿等，通常使用黃豆粉餅。 無機(jī)氮如 氨水 、硫酸銨等可適量使用。 由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機(jī)氮源含有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導(dǎo)致染菌的后果。采用植物油消沫仍舊是個好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用 泡敵 代替豆油。 無機(jī)鹽：磷酸鹽濃度對放線菌的生長和抗生素的合成影響很大，故應(yīng)該嚴(yán)格控制磷酸鹽的濃度。 滅 菌 滅菌指的是用化學(xué)或物理的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中所有的有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝流程。滅菌實質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌和介質(zhì)過濾除菌等幾種。 在 土霉素 的生產(chǎn)中，對培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過濾除菌的方法。 發(fā)酵 這一過程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。接種量一般為 20%。發(fā)酵周 期一般為 194 小時 。 發(fā)酵全程 3031℃ 分段培養(yǎng)，通氣量為 。當(dāng)接種后 發(fā)酵 pH北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 12 低于 時開始通氨， 培養(yǎng) 2040 小時，每 4 小時補(bǔ)一次 ， 每次 1015L，控氨水平在 45mg/100ml 以上 。根據(jù)發(fā)酵液殘?zhí)侵笛a(bǔ)入總糖，一般在 100 小時前殘?zhí)强刂?%%， 100 小時 150 小時控制 %%， 150 小時至放罐前 6 小時控制在 %。 在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時間取樣進(jìn)行生化分析和無菌試驗，觀察代謝變化、抗生素產(chǎn)生情況和有無雜菌污染。 土 霉素的提取生產(chǎn)工藝流程及各單元操作簡介 發(fā)酵液的預(yù)處理 土霉素因能和鈣、鎂等金屬離子，某些季銨鹽、堿等形成復(fù)合物而沉淀，在發(fā)酵過程中，這些復(fù)合物聚集在菌絲中，而在液體中濃度不高，因此，應(yīng)對發(fā)酵液進(jìn)行酸化的預(yù)處理使之釋放出來，以保證沉淀的收率和質(zhì)量。 通常采用草酸作為酸化劑，其去鈣較完全，析出的草酸鈣還能促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝結(jié)，提高濾液質(zhì)量，草酸屬于弱酸，比鹽酸、硫酸等對設(shè)備的腐蝕性小。但其價格較貴，并促使差向土霉素等異構(gòu)物的產(chǎn)生，因此在草酸做酸化劑時，溫度必須在 15℃ 以下，且盡量縮短操作時間。通常在 考慮土霉素穩(wěn)定性和成品質(zhì)量及成本的前提下， pH 控制在 。 發(fā)酵液的純化 發(fā)酵液中同時存在著許多有機(jī)和無機(jī)的雜質(zhì)，為了進(jìn)一步提高濾液質(zhì)量，為直接沉淀創(chuàng)造有利條件，可加入黃血鹽進(jìn)而硫酸鋅協(xié)同作用除去蛋白質(zhì)， 同時除去鐵離子 (黃血鹽和鐵離子生成普魯士藍(lán)沉淀 )，并加入硼砂，以提高濾液質(zhì)量。 濾液脫色 進(jìn)一步除去濾液中的色素和有機(jī)雜質(zhì)以提高濾液質(zhì)量，將濾液通過 1222 樹脂進(jìn)行脫色，該樹脂在酸性濾液中氫離子不活波，不能發(fā)生電離及離子交換作用，但能生成氫鍵，其生成的氫鍵能吸附溶液中的帶正電 的鐵離子、色素及其他有機(jī)雜質(zhì)，故能使土霉素濾液的色澤和質(zhì)量有所提高。樹脂在氫氧化鈉溶液中又氫型變成納型，失去氫鍵的活性，能使其吸附的色素和雜質(zhì)解離出來，再經(jīng)酸作用仍能回復(fù)活性，可重復(fù)使用?，F(xiàn)多采用板框式過濾機(jī)。 北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 13 沉淀結(jié)晶 經(jīng)預(yù)處理過的濾液加入堿化劑調(diào) pH 至等電點，使之沉淀結(jié)而從濾液中分離 。通常使用氨水 (含 23%NaHSO3或 Na2CO3 及尿素 )，既節(jié)約成本，又能起到抗氧化脫色作用，效果較好。條件控制為 ， 2830℃ 、結(jié)晶通常需要 2小時。目前通常采用連續(xù)結(jié)晶法。經(jīng)旋風(fēng)分離， 離心送至干燥。 干燥 物料經(jīng)粉碎后，通常采用旋風(fēng)干燥機(jī)干燥，并經(jīng)除塵可得到最終產(chǎn)物。 土霉素生產(chǎn)總工藝流程圖 相關(guān)工藝的改進(jìn) 盡管現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝已較為成熟，但是相關(guān)的工藝改進(jìn)仍在繼續(xù)，主要在以下幾個方面： 在結(jié)晶工藝中， 為縮短結(jié)晶時間，提高結(jié)晶設(shè)備的利用率， 通過研究 結(jié)晶過程中影響晶型的各種因素，改進(jìn)了發(fā)酵液預(yù)處理、結(jié)晶工藝。結(jié)果表明，在控制發(fā)酵液酸化 pH 值 、黃血鹽鈉加量 %、黃血鹽鈉和硫酸鋅配比 3： 結(jié)晶溫度等條件，找到了一個 較為適宜的發(fā)酵液預(yù)處理和結(jié)晶工藝，在結(jié)晶時間砂土孢子 斜面孢子 孢子培養(yǎng) ℃ 45 天 種子培養(yǎng) 30℃ 38h 一級種子培養(yǎng)液 種子擴(kuò)大培養(yǎng) 30℃ 48h 發(fā)酵 30℃ 194h 1： 補(bǔ)加液氨 濕晶體 旋風(fēng)干燥 土霉素堿成品 發(fā)酵液 酸化 %g/ml 草酸調(diào) ZnSO4 % 黃血鹽 % 酸化液 稀釋 200%v/v 稀釋液 板框過濾 濾液 樹脂脫色 1222 樹脂 脫色液 結(jié)晶 12%氨水 調(diào) 2830℃ 結(jié)晶液 分離洗滌 用濾后水淋洗再甩干 北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 14 僅為 47min 的情況下，可明顯改善土霉素晶型，使晶體粒度分布均勻，產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量得到進(jìn)一步提高 [1]。 在酸化提取工藝中，最佳酸化條件為： pH 值控制在 左右，黃血鹽鈉的用量控制在發(fā)酵液體積的 0. 35%時得到土霉素效價最高，為 5102U/g[2]。 在脫色吸附的過程中，改變樹脂的高徑比，可以提高鏟平的色澤 [3]。 目前，也有報道稱通過復(fù)合誘變 (經(jīng)饑餓培養(yǎng)、 52FU、 UV、咖啡因復(fù)合誘變處理 )的方法得到新的菌株，再用含高磷酸鹽的培養(yǎng)基定向篩選 , 得到高產(chǎn)突變菌株遺傳特性穩(wěn)定，代謝特性優(yōu)于出發(fā)菌株 ， 經(jīng) 57m3 發(fā)酵罐生產(chǎn)驗證 , 生產(chǎn)穩(wěn)定 , 低效價罐批減少 %，在磷酸鹽濃度提高到 %～ % 時，統(tǒng)計一年的正常罐批平均發(fā)酵效價比對照菌株提高 %[4]。 北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 15 第三章 物料衡算 霉素提取工段物料衡算 年產(chǎn) 800t/a(成品含量： 96%)，工作日 335 天，則日產(chǎn)量 G2=800*提取基本工藝參數(shù) 名稱 參數(shù) 名稱 參數(shù) 脫色崗位收率 % 發(fā)酵液效價 35000u/mL 結(jié)晶干燥崗位收率 86% 濾液 效價 11000u/mL 過濾崗位收率 116% 母液效價 1370u/mL 總收率 99% 濕晶體含水量 30% 發(fā)酵液密度 濾液密度 20%氨水密度 氨水加量 12% 成品含水量 % 脫色保留時間 3050 分鐘 酸化加水量 200%v/v 濾液通過樹脂罐的線速度控制在 土霉 素提取操作工藝參數(shù)一覽表 名稱 反應(yīng)時間 ( τ + τ、 )/h 裝料系數(shù) φ 酸化稀釋 4 結(jié)晶 8 干燥工段 G1*(1ω1)=G2*(1ω2) G1*(130%)=*(%) G1= 濕晶體 效價 =G2*Ud=*109*1000=*1012U 干燥 濕晶體 含水量 ω130% 干晶體 含水量 ω % 北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 16 酸化稀釋過濾工段 板框過濾收率 η1=116%，脫 色收率 η2=%，干燥潔凈收率 η3=86%，總收率η=99%。 脫色液效價 =*1012U/86%=*1012U 濾液效價 =*1012U/%=*1012U 稀釋液效價 =*1012U/116%=*1012U 忽略該過程損失，菌絲體帶走的效價不計 (m 發(fā)酵液 + v 發(fā)酵液 *(%+%+%)+200% *v 發(fā)酵液 *ρ 水 )*116%=m 濾液 +m 菌絲 35000* v 發(fā)酵液 *116%=*1012U m 發(fā)酵液 = v 發(fā)酵液 *ρ 發(fā)酵液 m 濾液 =*1012U /11000U/ml*ρ 濾液 將數(shù)據(jù)帶入以上方程得 解得 v 發(fā)酵液 = m 發(fā)酵液 = m 菌絲 = 則加入草酸 m=*106*%= 加入黃血鹽 m=*106*%= 加入 ZnSO4 m=*106*%= 加入水 V 水 =200%* v 發(fā)酵液 = m3 V 稀釋液 = m3 沉淀結(jié)晶工段 發(fā)酵 稀釋 過濾 發(fā)酵液 濾液 菌絲 %草酸 %黃血鹽 %ZnSO4 200%v/vH2O 北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 17 假設(shè)該過程體積不變，損失效價全部由母液帶走 效價平衡 *1012U=1370U/mL*V+*1012U V=273m3 加入 NH3 體積 =273*12%= m3 加入 NH3 質(zhì)量 =*103*= 由此可得提取過程的物料衡算表 進(jìn)料量 出料量 輸入物質(zhì)名稱 含量 質(zhì)量 輸出物質(zhì)名稱 含量 質(zhì)量 發(fā)酵液 35000U/mL 菌絲體 草酸 %g/mL 母液 1370U/mL 273 m3 黃血鹽 % g/mL 干晶體 1000 U/mg ZnSO4 % g/mL 水 m3 NH3 12% 總進(jìn)入 *1012U 總出料 *1012U 土霉素發(fā)酵工段物料衡算 計算基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 設(shè)計年產(chǎn)量 M = 800t/a(成品含量： 96%)，成品效價 Ud = 1000U/mg，年平均發(fā)酵水平 Uf = 35000U/mg，年工作日 m = 335 d/a。 發(fā)酵基礎(chǔ)工藝參數(shù) 土霉素的發(fā)酵周期 T 為 184 小時，輔助時間為 10 小時， 發(fā)酵中罐周期為 44 小時，輔助時間 4 小時 沉淀結(jié)晶 脫色液 12%NH3 母液 濕晶體 北京化工大學(xué)制藥工藝設(shè)計（論文） 18 發(fā)酵周期為 35 小時，輔助時間 3 小時 接種比為 20%，液體損失率為 15% 大罐一個發(fā)酵周期內(nèi)所需全料的量為： 32m3 大罐一個發(fā)酵周期內(nèi)所需稀料的量為： 17m3 逃液、蒸發(fā)、取樣、放罐損失總計為總料液的 15% 大、中、小罐通氣量分別為 、 、 (每分鐘內(nèi)單位體積發(fā)酵液通入的空氣的量 ) 氨氮的利用情況，培養(yǎng) 2040 小時，每 4 小時補(bǔ)一次 ,每次 1015L，控氨水 平在 45mg/100mL 以上 培養(yǎng)基配比： 小罐 中罐 大罐 全料 稀料 組成 配比（ %） 配比（ %） 配比（ %） 配比（ %） 配比（ %） 黃豆餅粉 淀粉 氯化鈉 碳酸鈣 磷酸二氫鉀 磷酸氫二鉀 植物油 4 1 大罐的物料衡算