【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的血漿樣品100 μL，依同法操作。上述色譜圖結(jié)果表明， min左右， min左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾AAAA和內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)的測(cè)定（Ⅰ為AAAA，Ⅱ?yàn)閮?nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)）。 空白血漿樣品色譜圖圖 空白血漿樣品加對(duì)照品色譜圖 取空白血漿100 μL，分別加入AAAA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，, ，， ng/mL的血漿樣品，按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，制備AAAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)X，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法[3]（權(quán)重系數(shù)：1/X2）進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明， ~ ng/mLl范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。三天方法學(xué)確證的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)表4，方法學(xué)確證的典型曲線見(jiàn)圖3。表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線（方法確證）測(cè) 日線性血漿樣品濃度（ng/mL）第一天Y = 104 X 104R = 第二天Y = 104 X+104R = 第三天Y = 104 X +103R = MeanSD日內(nèi)RSD（%） 日間RSD（%） RE（%）Y = 104 X 104R = 圖3 HPLCMS法測(cè)定血漿中AAAA的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線（方法學(xué)確證第一天） 定量下限取空白血漿100 μL，加入AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液（ ng/mL）20 μL， ng/mL的血漿樣品（5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一樣本測(cè)得濃度。結(jié)果表明， ng/mL。詳見(jiàn)表5。表5 AAAA的定量下限血漿樣品濃度（ng/mL）RE%RSD%LLOQ1LLOQ2LLOQ3LLOQ4LLOQ5取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，、 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品的濃度，求得方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLCMS法測(cè)定的日內(nèi)和日間精密度的RSD%達(dá)到試驗(yàn)要求[1]。詳見(jiàn)表6。表6 AAAA準(zhǔn)確度與精密度run血漿樣品濃度（ng/mL）123樣品數(shù)151515MeanSDRE（%）日內(nèi)RSD（%） 日間RSD（%） 重復(fù)進(jìn)樣考察本試驗(yàn)考察了在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和精密度。按“方法準(zhǔn)確度與精密度”項(xiàng)下的方法配制低、中、高三濃度的QC樣品（各1個(gè)樣本），每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算血漿樣品的濃度，求得重復(fù)進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLCMS法重復(fù)進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到試驗(yàn)要求。詳見(jiàn)表7。表7 重復(fù)進(jìn)樣考察結(jié)果血漿樣品濃度（ng/mL） 樣品數(shù)555Mean SD RE（%）RSD（%） 殘留考察取空白血漿100 181。L，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，制得空白血漿樣品（6樣本分析）；另取空白血漿100 μL，加入AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液（ ng/mL）20 μL， ng/mL的血漿樣品（4樣本分析），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下操作，于方法學(xué)確證第一天將含藥血漿樣品（ ng/mL，6樣本，其中兩樣本為標(biāo)準(zhǔn)曲線Sd7）和空白血漿樣品（6樣本）交替進(jìn)樣。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLCMS法AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）均無(wú)殘留。 提取回收率取空白血漿100 181。L，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下的方法配制低、中、高三個(gè)濃度（， ng/mL）的樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析；同時(shí)另取空白血漿100 181。L，除不加AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，向獲得的有機(jī)相中加入相應(yīng)濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 181。L和內(nèi)標(biāo)溶液50 181。L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積（5次測(cè)定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品的提取回收率符合有關(guān)規(guī)定[1]，內(nèi)標(biāo)回收率穩(wěn)定。詳見(jiàn)表8。表8 血漿樣品中AAAA和內(nèi)標(biāo)物（內(nèi)標(biāo)）的提取回收率回收率（%）AAAA的血漿濃度(ng/mL)內(nèi)標(biāo)血漿濃度（ng/mL）樣品數(shù)5555Mean（%）SD（%）RSD（%） 本試驗(yàn)考察了在相同試驗(yàn)條件下的基質(zhì)效應(yīng)。取空白血漿100 181。L，除不加AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，向獲得的有機(jī)相中加入低、中、高三種濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 181。L和內(nèi)標(biāo)溶液50 181。L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積，每一濃度進(jìn)行5樣本分析；同時(shí)另取相應(yīng)濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 181。L和內(nèi)標(biāo)溶液50 181。L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積（5次測(cè)定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，AAAA（低、中、高濃度）和內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果均在85%115%之間，AAAA和內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)在上述試驗(yàn)條件下均無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。詳見(jiàn)表9。表9 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果基質(zhì)效應(yīng)（%）AAAA的血漿濃度(ng/mL)內(nèi)標(biāo)血漿濃度（ng/mL）樣品數(shù)5555Mean（%）SD（%）RSD（%） 穩(wěn)定性試驗(yàn) 本試驗(yàn)考察了血漿樣品預(yù)處理前室溫放置24h的穩(wěn)定性、樣品處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器中（4℃）放置6h的穩(wěn)定性、血漿樣品經(jīng)歷三次冷凍解凍循環(huán)的穩(wěn)定性、血漿樣品于冰箱20℃保存45天的長(zhǎng)期穩(wěn)定性及儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性，以試驗(yàn)樣品的測(cè)得值與理論值比較所得結(jié)果考察樣品的穩(wěn)定性。取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在室溫下放置24h后，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品室溫放置24h穩(wěn)定。詳見(jiàn)表101。取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，在自動(dòng)進(jìn)樣器中（4℃）放置6h后測(cè)定。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品預(yù)處理后在進(jìn)樣器中（4℃）放置6h穩(wěn)定。詳見(jiàn)表102。表101AAAA血漿樣品室溫放置24h穩(wěn)定性考察結(jié)果AAAA的血漿濃度(ng/mL)樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）表102 AAAA血漿樣品預(yù)處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器中（4℃）放置6h的穩(wěn)定性　AAAA的血漿濃度(ng/mL)　樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL， , .0ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在 20 ℃下冷凍24h，然后在室溫自然解凍。完全解凍后，放回20 ℃下冷凍不少于12h。第二次在室溫自然解凍，再放回20 ℃下冷凍不少于12h，第三次在室溫自然解凍后，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品經(jīng)過(guò)三次冷凍解凍循環(huán)后穩(wěn)定。詳見(jiàn)表103。表103 AAAA血漿樣品經(jīng)過(guò)三次冷凍解凍循環(huán)后的穩(wěn)定性AAAA的血漿濃度(ng/mL)樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），于冰箱20℃保存，45天后按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)。結(jié)果表明，于冰箱20℃保存的AAAA血漿樣品在45天內(nèi)穩(wěn)定。詳見(jiàn)表104。表104 AAAA血漿樣品20℃保存長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察結(jié)果AAAA的血漿濃度(ng/mL)樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）分別于方法學(xué)驗(yàn)證前十天和方法學(xué)第一天考察AAAA與內(nèi)標(biāo)溶液4 ℃保存的穩(wěn)定性。于方法學(xué)驗(yàn)證前十天稱取AAA