【文章內容簡介】 的血漿樣品100 μL，依同法操作。上述色譜圖結果表明， min左右， min左右，血漿中內源性物質不干擾AAAA和內標物內標的測定（Ⅰ為AAAA，Ⅱ為內標內標）。 空白血漿樣品色譜圖圖 空白血漿樣品加對照品色譜圖 取空白血漿100 μL，分別加入AAAA系列標準溶液20 μL，, ，， ng/mL的血漿樣品，按“血漿樣品預處理方法”項下同法試驗，每一濃度進行雙樣本分析，制備AAAA的標準曲線。以待測物濃度（ng/mL）為橫坐標X，待測物與內標物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標Y，用加權最小二乘法[3]（權重系數(shù)：1/X2）進行線性回歸運算，求得的線性回歸方程即為標準曲線方程。結果表明， ~ ng/mLl范圍內線性關系良好。三天方法學確證的標準曲線結果見表4，方法學確證的典型曲線見圖3。表4 標準曲線（方法確證）測 日線性血漿樣品濃度（ng/mL）第一天Y = 104 X 104R = 第二天Y = 104 X+104R = 第三天Y = 104 X +103R = MeanSD日內RSD（%） 日間RSD（%） RE（%）Y = 104 X 104R = 圖3 HPLCMS法測定血漿中AAAA的典型標準曲線（方法學確證第一天） 定量下限取空白血漿100 μL，加入AAAA標準溶液（ ng/mL）20 μL， ng/mL的血漿樣品（5樣本），按“血漿樣品預處理方法”項下同法試驗，并根據(jù)當日標準曲線計算每一樣本測得濃度。結果表明， ng/mL。詳見表5。表5 AAAA的定量下限血漿樣品濃度（ng/mL）RE%RSD%LLOQ1LLOQ2LLOQ3LLOQ4LLOQ5取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標準溶液20 μL，、 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預處理方法”項下同法試驗，并根據(jù)當日標準曲線計算血漿樣品的濃度，求得方法的準確度與精密度。結果表明，本試驗所建立的HPLCMS法測定的日內和日間精密度的RSD%達到試驗要求[1]。詳見表6。表6 AAAA準確度與精密度run血漿樣品濃度（ng/mL）123樣品數(shù)151515MeanSDRE（%）日內RSD（%） 日間RSD（%） 重復進樣考察本試驗考察了在相同試驗條件下重復進樣的準確度和精密度。按“方法準確度與精密度”項下的方法配制低、中、高三濃度的QC樣品（各1個樣本），每個樣品重復進樣5次，計算血漿樣品的濃度，求得重復進樣的準確度和精密度。結果表明，本試驗所建立的HPLCMS法重復進樣的準確度和精密度達到試驗要求。詳見表7。表7 重復進樣考察結果血漿樣品濃度（ng/mL） 樣品數(shù)555Mean SD RE（%）RSD（%） 殘留考察取空白血漿100 181。L，除不加內標溶液外，其余按“血漿樣品預處理”項下操作，制得空白血漿樣品（6樣本分析）；另取空白血漿100 μL，加入AAAA標準溶液（ ng/mL）20 μL， ng/mL的血漿樣品（4樣本分析），按“血漿樣品預處理方法”項下操作，于方法學確證第一天將含藥血漿樣品（ ng/mL，6樣本，其中兩樣本為標準曲線Sd7）和空白血漿樣品（6樣本）交替進樣。結果表明，本試驗所建立的HPLCMS法AAAA和內標（內標）均無殘留。 提取回收率取空白血漿100 181。L，按“血漿樣品預處理”項下的方法配制低、中、高三個濃度（， ng/mL）的樣品，每一濃度進行5樣本分析；同時另取空白血漿100 181。L，除不加AAAA標準溶液和內標溶液外，按“血漿樣品處理”項下操作，向獲得的有機相中加入相應濃度的AAAA標準溶液20 181。L和內標溶液50 181。L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動相溶解后進樣分析，獲得相應峰面積（5次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結果表明，AAAA血漿樣品的提取回收率符合有關規(guī)定[1]，內標回收率穩(wěn)定。詳見表8。表8 血漿樣品中AAAA和內標物（內標）的提取回收率回收率（%）AAAA的血漿濃度(ng/mL)內標血漿濃度（ng/mL）樣品數(shù)5555Mean（%）SD（%）RSD（%） 本試驗考察了在相同試驗條件下的基質效應。取空白血漿100 181。L，除不加AAAA標準溶液和內標溶液外，按“血漿樣品處理”項下操作，向獲得的有機相中加入低、中、高三種濃度的AAAA標準溶液20 181。L和內標溶液50 181。L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動相溶解后進樣分析，獲得相應峰面積，每一濃度進行5樣本分析；同時另取相應濃度的AAAA標準溶液20 181。L和內標溶液50 181。L，渦旋混合，空氣流下吹干，以2mL流動相溶解后進樣分析，獲得相應峰面積（5次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質效應。結果表明，AAAA（低、中、高濃度）和內標內標基質效應考察結果均在85%115%之間，AAAA和內標內標在上述試驗條件下均無基質效應。詳見表9。表9 基質效應考察結果基質效應（%）AAAA的血漿濃度(ng/mL)內標血漿濃度（ng/mL）樣品數(shù)5555Mean（%）SD（%）RSD（%） 穩(wěn)定性試驗 本試驗考察了血漿樣品預處理前室溫放置24h的穩(wěn)定性、樣品處理后在自動進樣器中（4℃）放置6h的穩(wěn)定性、血漿樣品經(jīng)歷三次冷凍解凍循環(huán)的穩(wěn)定性、血漿樣品于冰箱20℃保存45天的長期穩(wěn)定性及儲備液的穩(wěn)定性，以試驗樣品的測得值與理論值比較所得結果考察樣品的穩(wěn)定性。取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標準溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在室溫下放置24h后，按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗。結果表明，AAAA血漿樣品室溫放置24h穩(wěn)定。詳見表101。取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標準溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預處理方法”項下同法試驗，在自動進樣器中（4℃）放置6h后測定。結果表明，AAAA血漿樣品預處理后在進樣器中（4℃）放置6h穩(wěn)定。詳見表102。表101AAAA血漿樣品室溫放置24h穩(wěn)定性考察結果AAAA的血漿濃度(ng/mL)樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）表102 AAAA血漿樣品預處理后在自動進樣器中（4℃）放置6h的穩(wěn)定性　AAAA的血漿濃度(ng/mL)　樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標準溶液20 μL， , .0ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在 20 ℃下冷凍24h，然后在室溫自然解凍。完全解凍后，放回20 ℃下冷凍不少于12h。第二次在室溫自然解凍，再放回20 ℃下冷凍不少于12h，第三次在室溫自然解凍后，按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗。結果表明，AAAA血漿樣品經(jīng)過三次冷凍解凍循環(huán)后穩(wěn)定。詳見表103。表103 AAAA血漿樣品經(jīng)過三次冷凍解凍循環(huán)后的穩(wěn)定性AAAA的血漿濃度(ng/mL)樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標準溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），于冰箱20℃保存，45天后按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗。結果表明，于冰箱20℃保存的AAAA血漿樣品在45天內穩(wěn)定。詳見表104。表104 AAAA血漿樣品20℃保存長期穩(wěn)定性考察結果AAAA的血漿濃度(ng/mL)樣品數(shù)555MeanRE（%）RSD（%）分別于方法學驗證前十天和方法學第一天考察AAAA與內標溶液4 ℃保存的穩(wěn)定性。于方法學驗證前十天稱取AAA