【文章內容簡介】 要性。3．6. 討論:副溶血弧菌是于1950年在日本的一次爆發(fā)性食物中毒中分離發(fā)現(xiàn)的。該菌存在于近海的海水，海底沉積物和魚類，貝殼等海產品中間。是我國大陸沿海地區(qū)食物中毒中最常見的一種病原菌。我們從副溶血弧菌中克隆了一具 Mg2+轉運能力的MgtE基因家族成員：VPMgtE。并對其進行了功能的初步研究。圖5 MM281, MM281pTrc, MM281VPMgtE 在含不同鋁離子濃度的LB平板上的互補結果。LB固體培養(yǎng)基pH=5, Mg2+離子濃度為100mM。序列分析顯示VPMgtE的蛋白序列與目前已知的MgtE家族成員顯示了部分相似性，多序列比對表明，它們在第2和第5個跨膜區(qū)和其它成員有較高的相似性。在一些特定的保守基序中MgtE家族成員具有完全的相似性，如第5個跨膜區(qū)的DP基序。最近，Angela Goytain等人從人類中克隆了一 Mg2+轉運基因：SLC41A1，它具有10個預測的跨膜區(qū)，該基因的表達可受Mg2+濃度的影響，在低濃度Mg2+下表達會上升[9]。序列分析表明它有兩個大的跨膜片段和細菌中的MgtE家族的第2和第5跨膜序列具有較高的相似性，在第5個跨膜區(qū)保守性最高，我們運用定點突變的方法研究了這些保守區(qū)域，結果和我們預測中一樣，當我們把這兩個跨膜區(qū)中的一些保守氨基酸突變以后，它的鎂離子轉運能力和野生型相比有明顯下降，甚至是完全喪失。同時我們還從不同的菌種克隆了3個MgtE家族成員并進行了功能鑒定(結果未列出)，它們在這些保守的基序中也是完全一致的，所以我們推測這些保守的氨基酸是MgtE家族發(fā)揮 Mg2+轉運功能所必需的。圖6 定點突變結果。圖中WT表示未進行突變的VPMgtE，其他標示代表的突變位點見表1。數(shù)據(jù)庫搜索顯示在古細菌（如Uncultured Methanogenic archaeon RC1）和真核生物（如錐蟲，雞，人）中都有發(fā)現(xiàn)，我們推測 MgtE和CorA家族一樣也是一個廣泛存在的基因家族，我們在植物和真菌中沒有發(fā)現(xiàn)該基因家族成員，但我們不能說它在這些生物中就不存在，可能只是因為MgtE家族序列相互間相似性較低在數(shù)據(jù)庫的搜索中才比較難于發(fā)現(xiàn)。SLC41A1在其它二價離子的轉運上和細菌中的MgtE有所不同，甚至MgtE各個成員間轉運其它二價離子也是有差別的，我們認為這些基因在轉運底物上的多樣性主要是由這些基因在其它部位序列的多樣性造成的。最近，Mao等發(fā)現(xiàn)擬南芥中的ATMGT7轉運 Mg2+是受到pH值的影響的[10]，我們也進行了類似的實驗，實驗結果表明VPMgtE轉運 Mg2+不受pH值的影響。同時我們在實驗中還發(fā)現(xiàn)VPMgtE在高濃度的Mg2+下的生長反而不如在低濃度的情況下生長的快（數(shù)據(jù)未列出），因此我們猜測VPMgtE可能為一類高親和性,轉運鎂離子的載體蛋白，為了確定其與何種離子偶聯(lián)進行 Mg2+的轉運，我們進行了鈉和氯離子做為偶聯(lián)劑的實驗，但與對照相比我們沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別。我們也運用半定量PCR的方法研究了該基因在低Mg2+濃度的情況下該基因的表達變化，我們發(fā)現(xiàn)該基因的表達不受Mg2+濃度的影響（結果未列出）。同時，Susana Merino等人發(fā)現(xiàn)，Aeromonas hydrophila 菌株中MgtE基因的突變可影響其游動能力和生物膜的形成[11]。我們在前面已經(jīng)提到， Mg2+對細胞膜的維持和穩(wěn)定具有很大的作用，所以可以認為，正是MgtE的缺失而影響了其細胞內 Mg2+的積累從而最終影響了其細胞膜的結構。 這給MgtE基因家族的Mg2+轉運能力提供了新的證據(jù)。 土壤酸化是影響全球農業(yè)收成的一個重大因素。其中土壤酸化最重要的一個方面就是鋁毒害的產生，因為鋁是地表含量最豐富的元素，在pH6的情況下，鋁主要是以各種結合態(tài)的形式存在，不產生毒害作用，但一旦pH6鋁就以離子的形式釋放出來，對農作物和其他各種生物產生毒害作用[16]，目前對生物特別是植物抵抗鋁毒害的分子機制還知之甚少，我們的研究為更好的理解生物抗鋁毒害的分子機制提供了新的證據(jù)。Li 等人通過同位素示蹤實驗發(fā)現(xiàn)Al3+可以抑制CorA家族基因ATMGT1的Mg2+轉運[4]，這說明這可能就是Al3+產生毒害作用的一個靶標。正是Al3+抑制了生物對Mg2+離子的吸收，從而影響了生物的正常生理活動而產生了毒害作用。人們也早就觀察到在鋁毒害存在的情況下，植物有缺鎂的生理現(xiàn)象[16]。這也從一個方面證實了鋁毒害產生的分子機制?？傊覀儚母比苎【锌寺×艘?Mg2+轉運基因并對其進行了功能的初步研究 。進一步的研究可集中于VPMgtE轉運 Mg2+的直接證據(jù)，如原子吸收分光光度實驗，同位素示蹤實驗。及其轉運Mg2+是否是離子偶聯(lián)的，又與何種離子偶聯(lián)。從而為更好地理解MgtE家族轉運 Mg2+的分子機制提供新的信息。參考文獻（References）：[1] Smith, RL., and Maguire, . 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Al toxicity in Physiol 112: 11011109水稻胚乳中wee1基因表達模式的研究湖南師范大學生命科學學院學生姓名： 毛凱壯 N42030236 專業(yè)：生物科學 班級：2003級2班唐貴華 N42030119 專業(yè)：生物科學 班級：2003級1班指導教師：姜孝成教授實驗主要設備和材料：PCR儀、高速冷凍離心機、紫外檢測儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、超低溫冰箱；日本晴（粳稻）不同發(fā)育時期的胚乳（1—15d）實驗目的：擬初步研究水稻胚乳中wee1基因表達的模式，了解wee1在水稻胚乳發(fā)育不同時期表達量的差異及作用。實驗原理：胚乳是水稻種子的主要成分，其發(fā)育的正常與否直接關系到水稻的產量。水稻等禾谷類作物在胚乳發(fā)育早期的細胞周期存在核內復制現(xiàn)象，Wee1基因表達對核內復制有調節(jié)作用從而影響胚乳的發(fā)育及其大小。實驗過程：提取水稻不同發(fā)育時期胚乳的總RNA，通過兩步法RTPCR檢測并確定wee1表達的時期及在不同時期的表達量的差異。RNA提取分別提取日本晴不同發(fā)育時期胚乳的總RNA 藥品配制及器皿處理所使用到的金屬和玻璃器皿經(jīng)蒸餾水和超純水洗凈后用錫箔紙包裝，180 ℃烘烤12 h。% DEPC于37 ℃浸泡12 h，并且高壓滅菌30 min。抽提緩沖液（為防止RNA酶降解，% DEPC處理過的超純水配制后高壓滅菌30 min）：200 mM TrisHCl (pH )，100 mM LiCl, 50 mM EDTA, % SDS，2% PVP (Sigma分裝, PVP40)；2% BSA (Sigma分裝)；10 mM DTT (Sigma) (PVP，BSA和DTT先分別配成母液， μm過濾除菌，在使用前加入 )。蛋白酶K（Merk,Germany）。飽和酚配制的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）。氯仿/異戊醇（24:1）。2 M LiCl：DEPC處理，高壓滅菌30 min。8 M LiCl：DEPC處理，高壓滅菌30 min。3 M乙酸鈉，pH ：DEPC處理，高壓滅菌30 min。70% 乙醇：% DEPC處理過的雙蒸水配制。100% 乙醇。 操作過程（1）將適量體積的抽提緩沖液移至100 ml離心管中，預熱至56 ℃，在使用之前加入PVP、BSA及DTT至終體積20 ml，充分混勻。研缽和研杵用液氮預冷。（2）從80 ℃，加入液氮后，將胚乳充分研磨成粉末，倒入上述預熱的抽提緩沖液中，顛倒離心管使之充分混勻。（3）待離心管冷卻至室溫，加入200μl蛋白酶K（20 mg/ml），37 ℃水浴10 min。（4）加入12 ml預熱的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），用力搖動數(shù)分鐘后，置于56 ℃水浴20 min，期間劇烈搖動34次。（5）4 ℃下12000 g離心15 min。（6）將上清轉移至一新的100 ml離心管中，離心8 min。（7）將上清液迅速轉移至一新的100 ml離心管中，加入20 ml氯仿/異戊醇（24:1）。（8）將混合物在冰上旋搖5 min混勻。4 ℃下12000 g離心15 min。（9）用等體積的氯仿/異戊醇（24:1）將上清夜抽提兩次。（10）將上清液轉移至一新的100 ml離心管中，加入1/3體積8 M LiCl，使LiCl終濃度為2 M，蓋緊管口，倒置幾次，使之充分混勻，4 ℃靜置過夜。使之沉淀。（11）4 ℃下12000 g離心15 min，得到RNA沉淀。（12）小心將上層液體倒去，用25 ml預冷的LiCl(2 M)清