【文章內容簡介】 mM (10X)的儲存液，℃保存,工作濃度為10 mM。 Dex溶于1223ml乙醇中，*103M。*，濃度為1*105M(100X),分裝，20℃保存，工作濃度為100nM。配制10%的氯代十六烷基吡啶目的：為茜素紅定量測OD值做準備步驟：1. ，配制成10mM磷酸氫二鈉溶液。2. 稱取5g氯代十六烷基吡啶加入50mL磷酸氫二鈉溶液（10mM）中溶解。3. 放入離心管內加熱溶解備用；4. 最終10%的氯代十六烷基吡啶應呈微黃色。茜素紅染色實驗目的：了解各種合金促進細胞外基質的情況實驗原理：茜素紅和鈣離子以鰲和方式形成復合物，通過茜紅素染色，可產(chǎn)生桔紅色沉積（鈣結節(jié)）用以識別組織細胞的鈣鹽成分，鈣鹽變化是骨細胞增殖分化和骨組織成骨潛能的標志之一，鈣結節(jié)是成骨分化晚期的標志。材料數(shù)量：每種材料3個時間點（7day，14day，21day），每個時間點4個平行樣。步驟：1. 準備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在材料上種細胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板）[細胞密度根據(jù)孔板和材料可進行調整]，使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。每個材料4個復孔。3. 細胞貼壁生長至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導后期，需每天對細胞進行換液，以保證能夠提供足夠的營養(yǎng)；同時，在誘導后期，對細胞進行換液一定要小心），棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。4. PBS洗3次，加入20 mg/ml ℃培養(yǎng)箱染色30min；(染料要沒過材料)5. 棄茜素紅，PBS洗6次至無色。6. 正置顯微鏡拍照。7. 每孔加入氯代十六烷基吡啶（10%）（要沒過材料表面）溶解后取150ul裂解液加入96孔板內于620nm波長處測OD值注意事項：茜素紅染色的成功關鍵步驟是固定液的選擇和茜素紅的PH，這個很重要。如上圖所示，藍色箭頭指示的為鈣結節(jié)。從圖a可知，四種材料均能夠促進rBMSCs細胞的成骨分化，經(jīng)過等離子注入的材料對細胞的促成骨效果比純鈦強，且Zn/AgPIII材料對大鼠骨髓間充質干細胞的促成果效果更佳有效。從圖b的吸光度可以看出結果和圖a是一致的。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium, Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,天狼星紅染色目的：考察Titanium alloys 表面改性后對細胞成骨誘導后膠原蛋白結果的影響細胞：小鼠胚胎成骨細胞MC3T3E1直接實驗方案：1. 準備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在材料上種細胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板），使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。每個材料4個復孔。3. 細胞貼壁生長至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導后期，需每天對細胞進行換液，以保證能夠提供足夠的營養(yǎng)；同時，在誘導后期，對細胞進行換液一定要小心），棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min 。4. PBS洗3次，%天狼星紅置于37℃培養(yǎng)箱染色30min；(染料要沒過材料)5. 棄天狼星紅，PBS洗6次至無色。6. 用正置顯微鏡拍照。7. M NaOH/methanol (1:1) 溶解后取150ul裂解液加入96孔板內于540nm波長處測OD值Nonviral oligonucleotide antimiR138 delivery to mesenchymal stem cell sheets and the effect on osteogenesis, Biomaterials 35 (2014) 7734 7749.堿性磷酸酶ALP 實驗目的：ALP是成熟成骨細胞的標志性酶，檢測材料是否存在促成骨作用實驗原理：Paranitrophenyl phosphate (pNPP)是一種常用的磷酸酶顯色底物，在堿性條件下，可在堿性磷酸酶作用下生成paranitrophenol，呈黃色產(chǎn)物，可在405nm檢測吸光度。產(chǎn)物黃色越深，吸光度越大，說明堿性磷酸酶檢活性越高，反之則酶活性越低。據(jù)此通過比色分析就可以計算出堿性磷酸酶活性水平，進而反應出材料是否有促成骨作用。實驗周期：7,14，21天實驗材料數(shù)量：每種材料三個時間點，每個時間點4個平行樣。實驗步驟：1. 準備小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,先用無水乙醇浸泡材料并超聲510min后，用75%的乙醇滅菌30 min，將材料轉移至孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍.2. 取70%80%對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清aMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數(shù)，在材料上種細胞，密度為1*104/孔（24孔板）和5*103/孔（96孔板），使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面，輕微震蕩，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。每個材料4個復孔。3. 細胞貼壁生長至70%80%后，吸去培養(yǎng)基，加入含有成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基（50mg/mLVC, 100 nM dexamethasone, 10 mM βglycerophosphate）繼續(xù)培養(yǎng)7,14，21天后（每三天需更換含成骨誘導液的新鮮培養(yǎng)基，在誘導后期，需每天對細胞進行換液，以保證能夠提供足夠的營養(yǎng)；同時，在誘導后期，對細胞進行換液一定要小心），至既定時間點()后，取出相應時間點培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，PBS/生理鹽水清洗兩遍（要輕柔，最好用巴氏吸管），500ul（24孔板）或者300ul（48孔板）%tritonx100裂解過夜4度。（細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞和細胞，如果有必要需進行適當勻漿，隨后離心取上清，用于堿性磷酸酶的檢測。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑。樣品可以80℃凍存，但需避免反復凍融。）4. 試劑準備：將所有試劑取出，恢復至室溫使用。a. 顯色底物溶液：取一管顯色底物，充分溶解和混勻，冰上放置。新鮮配制的顯色底物溶液需在6小時內使用。b. 標準品工作液：取10 uL p nitrophenol溶液 (10mM)。5. 取各種裂解后溶液50 uL順序加入到96孔板內，而后在每孔中再加入50uL pNpp工作液，37℃，孵育30min。同時設置空白組和標準曲線組。（空白組為50 uL顯色底物+ 50uL檢測緩沖液，標準曲線組分別為1232和40微升pNpp +9987660微升顯色底物。）6. 每孔加入100 uL反應終止液終止反應。此時，標準品或有堿性磷酸酶活性的孔會呈現(xiàn)不同深淺的黃色。7. 在405nm測定吸光度。如果不能測定405nm，也可以在400415nm范圍內檢測吸光度。如果不能立即測定，可以在數(shù)小時內完成測定，所顯現(xiàn)的黃色在數(shù)小時內穩(wěn)定。8. 堿性磷酸酶活性單位的定義： 的diethanolamine(DEA) 緩沖液中，37 ℃條件下，每分鐘水解paranitrophenyl phosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個DEA酶活力單位。，25℃條件下，每分鐘水解paranitrophenyl phosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個Glycine酶活力單位。一個Glycine酶活力單位約相當于3個DEA酶活力單位。本試劑盒測定的是DEA酶活力單位。9. 取25ul各種裂解液加入96孔板內，每孔加入100ul的BCA(A:B=50:1)（測定細胞內總蛋白）,37℃，孵育30min。在酶標儀下測定其OD值。（562nm）{需做BSA蛋白的標準曲線，以便計算總蛋白。}10. 根據(jù)酶活性定義，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。Synergistic effects of dual Zn/Ag ion implantation in osteogenic activity and antibacterial ability of titanium,Biomaterials 35 (2014) 7699 7713,細胞凋亡細胞凋亡（apoptosis）與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。因此，有關凋亡的研究在臨床和基礎等各個領域已經(jīng)廣泛開展，凋亡細胞的檢測方法顯得非常重要。細胞凋亡檢測可以：（1）用于腫瘤細胞和組織在內的不同種類病理標本研究；（2）應用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；（3）對相關疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。一、實驗原理細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。二、實驗方法和步驟1. 流式細胞分析操作方法：1) 細胞收集：對貼壁生長細胞，離心收取培養(yǎng)液內的懸浮細胞，并用不含EDTA的胰酶消化貼壁細胞（消化時間不宜過長，否則容易引起假陽性），合并兩部分細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。2) 用冰冷PBS洗滌細胞后， 1000g離心5 min，棄上清，加入500uL的Binding Buffer輕輕重懸細胞。3) 加入5uL Annexin VFITC混勻后，加入5uL DAPI，輕輕混勻，避光，反應515min4) 在1h內，進行流式細胞上機檢