【文章內(nèi)容簡介】 hern印跡法區(qū)別：（１）靶核酸：Ｎ所檢測(cè)的靶核酸是ＲＮＡ，Ｓ是ＤＮＡ（２）ＲＮＡ電泳：ＲＮＡ樣品依其分子量大小在變性膠中進(jìn)行分離，凝膠中需加入變性劑，防止ＲＮＡ分子形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，維持其單鏈線性狀態(tài)。（３）轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，不需要再進(jìn)行變性和中和，直接采用毛細(xì)管虹吸法將膠中的ＲＮＡ轉(zhuǎn)移到膜上，也可采用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移法。５２　核酸原位雜交步驟：（１）組織或細(xì)胞的固定（２）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理（３）探針的選擇和標(biāo)記（４）雜交（５）雜交結(jié)果檢測(cè)。５３?。遥危撩副Ｗo(hù)分析法（ＲＰＡ）基本程序步驟：（１）制備待測(cè)ＲＮＡ（２）ＲＮＡ探針的標(biāo)記（３）雜交（４）除去單鏈ＲＮＡ（５）電泳分析５４　探針及標(biāo)記物的種類：探針（１）cＤＮＡ探針（２）基因組ＤＮＡ探針（３）寡核苷酸探針（４）ＲＮＡ探針。標(biāo)記物：（１）核素標(biāo)記物（２）非核素標(biāo)記物：半抗原、配體、熒光素、化學(xué)發(fā)光探針。５５核酸體外標(biāo)記法分為化學(xué)法和酶法：（１）化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)）發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上。（２）酶法（酶促標(biāo)記法）：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核酸苷酸（ＮＴＰ或dＮＴＰ）分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻入到探針分子中去，或?qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基團(tuán)交換到探針分子上。５６　酶促標(biāo)記法：（１）缺口平移法；（２）隨機(jī)引物法（３）ＰＣＲ標(biāo)記法（４）末端標(biāo)記法５７缺口平移法原理：利用適當(dāng)濃度的ＤＮaseＩ在ＤＮＡ雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產(chǎn)生一個(gè)５末端和一個(gè)３末端，３末端即可作為引物，在大腸桿菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３ＤＮＡ聚合酶活性的催化下，以互補(bǔ)的ＤＮＡ單鏈為模板，依次將dNTP連接到切口的３端羥基上，合成新的ＤＮＡ單鏈；同時(shí)ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３核酸外切酶活性在切口處將舊鏈人５末端逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原ＤＮＡ分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代。５８?。校茫一具^程：（１）變性：通過加熱至９５度左右，使ＤＮＡ雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈ＤＮＡ，作為反應(yīng)的模板。（２）退火：將溫度降至引物的Ｔm值左右或以下，引物與ＤＮＡ模板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，形成雜交鏈。（３）延伸：當(dāng)反應(yīng)體系溫度升至７０度左右時(shí)，ＴaqDNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的５－３ＤＮＡ鏈延伸反應(yīng)，形成新生ＤＮＡ鏈。５９?。校茫乙镌O(shè)計(jì)的基本要求：（１）引物長度一般為１５－３０個(gè)核苷酸。（２）引物中的堿基組成盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。（３）引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（４）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免３端的互補(bǔ)重疊。（５）引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過７０％，引物３末端連續(xù)８?jìng)€(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增（６）引物３端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板ＤＮＡ配對(duì)（７）引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的５端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響ＰＣＲ反應(yīng)的進(jìn)行。６０ＰＣＲ技術(shù)的要類型：（１）筑巢ＰＣＲ（２）共享引物ＰＣＲ（３）多重ＰＣＲ（４）不對(duì)稱ＰＣＲ（５）錨定ＰＣＲ（６）反向ＰＣＲ（７）彩色ＰＣＲ（８）原位ＰＣＲ（９）定量ＰＣＲ（１０）差異顯示ＰＣＲ（１１）重組ＰＣＲ。６１?。校茫曳磻?yīng)體系包括：核酸模板、引物、ＴaqＤＮＡ聚合酶、緩沖液、Ｍg2+、dＮＴＰs、反應(yīng)溫度與循環(huán)次數(shù)。６２　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及基本原理：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物?；驹恚簩⒛康幕颍ɑ蚧蚪M片段）用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物園的輸卵管（或子宮）中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。導(dǎo)入基因的方法有顯微注射法、胚胎干細(xì)胞法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載體法。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源ＤＮＡ的檢測(cè)：（１）染色體及基因水平的檢測(cè)：斑點(diǎn)雜交、Ｓouthern雜交和ＰＣＲ分析、原位雜交等；（２）轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)：利用Northern雜交、RNase保護(hù)分析及ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因mRNA的存在及表達(dá)水平。（３）蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，采用Western印跡分析法。６３　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用：（１）對(duì)基因組織或階段特異表達(dá)的研究（２）通過研究轉(zhuǎn)入外源基因后的新表型，可以發(fā)現(xiàn)基因的新功能；（３）導(dǎo)入外源基因后，由于基因的隨機(jī)插入，可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源基因的突變，對(duì)這些突變表型進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)新的基因（４）可用于只在胚胎期才表達(dá)的基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究（５）建立研究外源基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型（６）對(duì)遺傳性疾病的研究（７）建立人類疾病的動(dòng)物模型，（８）動(dòng)物新品種的培育（９）基因產(chǎn)品的制備（１０）在免疫學(xué)中，可用于對(duì)免疫機(jī)制、免疫相關(guān)疾病的研究及建立免疫性疾病動(dòng)物模型等。６４　轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)路線：（１）選擇及獲得外源目的基因，（２）受體細(xì)胞培養(yǎng)，（３）選用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因方法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（４）將轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng)（５）篩選陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞（６）培植陽性轉(zhuǎn)化植株（７）轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。６５轉(zhuǎn)基因植物在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用：（１）可成為新的疫苗來源，植物病毒也成為人類疫苗的可能來源（２）因?yàn)橹参锊《緦?duì)動(dòng)物不致病，因此可利用植物病毒表達(dá)抗原蛋白的片段，以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。（３）還可產(chǎn)生單抗，作為化療藥物的靶向載體。６６基因打靶的必備條件：（１）胚胎干細(xì)胞：ＥＳ細(xì)胞的特點(diǎn)：能在體外培養(yǎng)，并保留發(fā)育的全能性。體外培養(yǎng)要維持細(xì)胞的分裂增殖與正常的核型，同時(shí)抑制細(xì)胞的分化。（２）打靶載體：a、neo陽性篩選標(biāo)志：b、ＨＳＶ－tk陰性篩選標(biāo)志：６７　構(gòu)建打靶載體的基本過程：（１）獲得目的基因（待敲除基因）的同源片段，將此ＤＮＡ片段克隆到一般的質(zhì)粒載體中；（２）從重組質(zhì)粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列，只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端；（３）將neo基因克隆到帶有目的基因同源順序的線性質(zhì)粒中，使之位于殘留目的基因同源順序的中間；（４）在目的基因同源順序的外側(cè)線性化重組質(zhì)粒載體，將ＨＳＶ－tk基因克隆到此線性載體中。６８?。模危列酒夹g(shù)的應(yīng)用：（１）ＤＮＡ序列測(cè)定（２）基因表達(dá)分析（３）基因組研究（４）基因診斷（５）藥物研究與開發(fā)（藥物篩選、新藥發(fā)現(xiàn)、合理用藥、中草藥鑒定和真假藥辨別）６９引起ＤＮＡ一級(jí)結(jié)構(gòu)變異的誘變劑的作用機(jī)制：（１）堿基類似物誘發(fā)突變（２）改變ＤＮＡ的化學(xué)結(jié)構(gòu)（３）結(jié)合到ＤＮＡ分子上誘發(fā)移碼突變（４）紫外線及其其它射線引起的ＤＮＡ分子變化。７０　突變類型：點(diǎn)突變（轉(zhuǎn)換和顛換）、缺失（一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從ＤＮＡ大分子上消失）、插入（一個(gè)原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入ＤＮＡ大分子中間）、倒位（ＤＮＡ鏈內(nèi)重組，使其中一段方向反置）７１　突變所引起的遺傳效應(yīng)包括：（１）遺傳密碼的改變：錯(cuò)義突變、無義突變、同義突變、移碼突變；（２）對(duì)mRNA剪接的影響（3）蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失。72病毒癌基因與細(xì)胞癌基因的不同之處：（１）病毒癌基因與細(xì)胞癌基因相比，通常丟失了兩端的某些序列。（2）病毒癌基因沒有內(nèi)含子，而細(xì)胞癌基因中通常含有內(nèi)含子或插入序列。（3）病毒癌基因與同源的細(xì)胞原癌基因在外顯子序列中也有微小的差別。（4）病毒癌基因常會(huì)出現(xiàn)堿基取代或堿基缺失等突變，而細(xì)胞癌基因則較少發(fā)現(xiàn)這一類突變。73癌基因家族：src\ras\myc\sis\erb\myb.74 RB抑癌基因機(jī)制：RB蛋白在靜止細(xì)胞中與E2F結(jié)合成復(fù)合物，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性；P105RB通過抑制多種原癌基因如cmyc\cfos的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖。75 P53抑制細(xì)胞生長機(jī)制：（1）P53蛋白可抑制cyclinA的表達(dá)，故P53基因的變異或缺失，可使cyclinA過量表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞在DNA復(fù)制不完全時(shí)即進(jìn)入M期而致癌，（2）P53能阻礙DNA聚合酶與DNA復(fù)制起始復(fù)合物的結(jié)合而抑制DNA復(fù)制的啟動(dòng)，進(jìn)而阻止DNA的復(fù)制。（3）P53的酸性氨基酸末端結(jié)構(gòu)區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活作用，它能激活一些抑制細(xì)胞分裂的基因而間接抑制細(xì)胞增殖。（4）正常P53還能抑制cmyc\ras基因或腺病毒E1A對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用。76 癌基因活化致癌的主要機(jī)制：（1）原癌基因點(diǎn)突變（2）原癌基因獲得外源啟動(dòng)子而激活（3）原癌基因因甲基化程度降低而激活（4）原癌基因的拷貝數(shù)增加（5）基因易位或重排使原癌基因激活77 腫瘤發(fā)生的多基因協(xié)同作用：該假說認(rèn)為細(xì)胞癌變是多步驟、多重打擊的復(fù)雜過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各階段，至少需要兩個(gè)或多個(gè)不 同的癌相關(guān)基因的異常激活或失活，才有可能引起細(xì)胞的癌變。直腸結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程可分6個(gè)階段：上皮細(xì)胞過度增生、早期腺瘤、中期腺瘤、晚期腺瘤、腺癌和轉(zhuǎn)移癌。從正常上皮細(xì)胞到上皮細(xì)胞過度增生可能涉及FAP基因異常（突變或失活），從早期腺瘤到中期腺瘤涉及Kras的異常（突變），從中期腺瘤到晚期腺瘤涉及DCC基因異常（如丟失），從晚期腺瘤到直腸結(jié)腸癌涉及P53基因異常（丟失），癌轉(zhuǎn)移還涉及到其它基因的激活與失活，如nm23基因表達(dá)異常、血管生長因子基因表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Ras刺激下增高等。78 基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)（1）核酸分子雜交（2）聚合酶鏈反就（PCR）（3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)（4）限制酶酶譜分析（5）D