【文章內(nèi)容簡介】 無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng) ? 植物轉(zhuǎn)基因通常利用抗生素類、除草劑類及有毒物質(zhì)基因作為選擇標(biāo)記，選擇轉(zhuǎn)化體。? 獲得轉(zhuǎn)基因植株后，選擇標(biāo)記基因就失去存在的價值，繼續(xù)表達(dá)的產(chǎn)物會帶來一些不良后果。主要表現(xiàn)在：– (1) 篩選劑影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及分化；– (2) 關(guān)于選擇標(biāo)記基因?qū)】岛铜h(huán)境的影響問題尚沒有定論，影響轉(zhuǎn)基因植物投入市場；– (3) 由于現(xiàn)有可利用的選擇標(biāo)記基因有限，應(yīng)用相同的選擇標(biāo)記基因向植物疊加外源基因存在一定的困難。– 解決這一問題的根本途徑: 剔除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因。 （1）無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得? 1）共轉(zhuǎn)化法（cotransformation） – 同時使用 2 個獨立的DNA載體（分別含有目的基因、選擇標(biāo)記基因），對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。– 當(dāng) 2 個基因分別整合在受體的不同染色體上時，轉(zhuǎn)化植株后代經(jīng)有性階段的分離重組，選擇標(biāo)記基因與目的基因分離，即可獲得只含有目的基因而不帶選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植株，從而達(dá)到去除標(biāo)記基因的目的。– 不同轉(zhuǎn)化載體中的轉(zhuǎn)基因共整合頻率往往較低，且常整合在同一位點，造成基因連鎖，使得共轉(zhuǎn)化的應(yīng)用受到了限制。– 解決辦法：雙TDNAs系統(tǒng)（超級雙元載體），即將分別帶有目的基因和選擇標(biāo)記基因的兩個TDNA裝載在同一個載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，能較大地提高共轉(zhuǎn)化頻率。（1）無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得? 2）位點特異性重組系統(tǒng)（sitespecific rebination system）– 利用重組酶催化兩個短的、特定DNA序列間的重組，以去除選擇標(biāo)記基因。– 目前，應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的重組酶系統(tǒng)主要有Cre/loxP系統(tǒng)、FLP/FRTs系統(tǒng)、和R/RS系統(tǒng)等。 （1）無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得? 3）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)– 通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入的基因可以在基因組中重新定位。– Ac/Ds和Spm/dSpm是研究得最深的兩個轉(zhuǎn)座子家族。– 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可被開發(fā)用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來培育安全無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株?？捎脙煞N方法實現(xiàn)：? a）標(biāo)記基因被置于轉(zhuǎn)座子與重復(fù)序列Ds之間，轉(zhuǎn)座作用發(fā)生后，標(biāo)記基因即隨轉(zhuǎn)座作用而跟目的基因分離或丟失；? b）將目的基因置于Ds之間，目的基因?qū)㈦S轉(zhuǎn)座作用的發(fā)生而與選擇標(biāo)記基因分離。 （2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得? 使用安全標(biāo)記基因作選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理：不將非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死，而是轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠借助熒光顯微鏡活體檢測，或在一定程度上使轉(zhuǎn)化細(xì)胞處于某個有利的代謝條件下，從而篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。? 傳統(tǒng)的選擇系統(tǒng)稱為負(fù)選擇系統(tǒng)，相應(yīng)地這種選擇系統(tǒng)稱之為正選擇系統(tǒng)。? 正選擇系統(tǒng)的主要優(yōu)點在于選擇劑無毒副作用，而且在多數(shù)情況下有利于轉(zhuǎn)化植株的再生，從而提高轉(zhuǎn)化率。（2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得? 目前，有應(yīng)用前景的安全標(biāo)記基因主要包括一些無毒性的化學(xué)物質(zhì)或與植物生長有關(guān)的蛋白基因，如– GUS基因（β半乳糖葡萄糖醛酸酶）– GFP基因（綠色熒光蛋白）– 木糖異構(gòu)酶基因– 甘露糖－6－磷酸異構(gòu)酶基因– 異戊烯轉(zhuǎn)移酶Ipt基因– 發(fā)根農(nóng)桿菌Rol基因（2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得? 根據(jù)植物細(xì)胞對不同糖類碳源的代謝能力，利用糖類作為篩選劑的正篩選系統(tǒng)，顯示出巨大的應(yīng)用潛力。? 這類標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物是某種糖類的分解代謝酶，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能利用篩選劑糖類作為主要碳源，可在篩選培養(yǎng)基上生長擴(kuò)增，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則處于饑餓狀態(tài)，生長被抑制但不被殺死，依此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。? 此外，干擾氨基酸代謝的選擇方法也漸漸發(fā)展起來，顯示出了誘人的前景。 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定轉(zhuǎn)基因植物的檢測標(biāo)準(zhǔn)（Potrykus，1991）– （1）要設(shè)立嚴(yán)格的對照（包括陽性和陰性對照）；– （2）提供轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株的外源基因整合和表達(dá)的分子生物學(xué)證據(jù)，包括物理數(shù)據(jù)（PCR、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、Western印跡雜交等）與表型數(shù)據(jù)（酶活性分析或其它）；– （3）提供外源基因控制的表型性狀證據(jù)（如抗蟲）；– （4）根據(jù)該植物的繁殖方式（有性或無性），提供穩(wěn)定遺傳證據(jù)，有性繁殖植物需要有目的基因控制的表型性狀傳遞給后代的證據(jù)，無性繁殖植物需要有繁殖一代穩(wěn)定遺傳的證據(jù)。? 因此，要獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，在轉(zhuǎn)基因操作后，要做如下四步： 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定（1）篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在選擇壓力下再生轉(zhuǎn)化植株。（2）對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，即– Southern印跡雜交證明外源基因在植物染色體的整合，– Southern原位雜交證明外源基因在染色體賞的整合位點，– Northern印跡雜交證明外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄，生成特異mRNA，– Western印跡雜交證明外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄及翻譯生產(chǎn)特異蛋白質(zhì)。（3）進(jìn)行性狀鑒定及外源基因的表達(dá)調(diào)控研究。（4）遺傳分析，證明轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性，并獲得轉(zhuǎn)基因植物品種，應(yīng)用于生產(chǎn)。 外源基因整合的鑒定? （1） PCR檢測? （2） Southern印跡雜交? （3）DNA芯片技術(shù)（1）PCR檢測? PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制合成過程，在體外進(jìn)行的特異性擴(kuò)增某DNA片段的方法。? PCR的原理：利用DNA聚合酶能夠以引物3’OH為起點，催化dNTP按模板順序，合成互補(bǔ)鏈。? 是一種體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片斷的核酸合成技術(shù)。此方法簡便快捷，已成為檢測轉(zhuǎn)基因植物的有效技術(shù)之一。（1）PCR檢測? PCR反應(yīng)包括3個基本步驟：①變性(denaturation)：雙鏈DNA 在94℃下熱變性，解離成單鏈。②退火(annealling)：溫度突然降到引物Tm值以下時，引物與模板DNA互補(bǔ)序列雜交。因模板DNA分子結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比引物復(fù)雜，且反應(yīng)體系中引物的摩爾數(shù)遠(yuǎn)大于模板DNA，故在退火溫度下引物與模板DNA分子可形成互補(bǔ)雜交鏈，而單鏈模板DNA間互補(bǔ)形成雙鏈的機(jī)會少得多。③延伸(extension): 在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的條件下，DNA聚合酶依賴其5′→3′的聚合酶活力，以引物為起始，互補(bǔ)的DNA鏈為模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互補(bǔ)鏈。（1）PCR檢測l 經(jīng)過變性、退火、延伸3個溫度的循環(huán)，模板上介于兩引物之間的片段不斷擴(kuò)增。目的片段以2n形式積累，經(jīng)25～30個循環(huán)后，目的片段的DNA量可達(dá)到106倍。l PCR檢測時，以被檢組織DNA為模板，以外源基因序列設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。若被檢植株基因組中含有外源基因，則可得到擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠上就會出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，反之則無。（1）PCR檢測? 檢測的程序： 1）引物設(shè)計 根據(jù)外源基因兩端的序列，使用OLIGO或Primer Select等軟件設(shè)計引物。也可采用較簡單有效的方法得到引物，即以目的基因5′端20個堿基序列做5′引物，以該基因3′端20個堿基順序的互補(bǔ)序列做3′端引物（被檢基因的序列已知）。（1）PCR檢測 2）模板DNA的制備① 稱5~10mg供試材料，置Eppendorf管中，加入50～100ul NaOH()，用玻璃棒研碎，靜置片刻。② 少許離心，獲取上清液。③ 取5ul上清液轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中，加入Tris緩沖液（100mmol/Ltris，）至50～500ul，備用。– 此法主要用于PCR大量快速檢測轉(zhuǎn)基因植物。有些植物以此法提取的DNA為模板，就可獲得較好的PCR擴(kuò)增效果。而有些植物需要采用較為復(fù)雜的總DNA提取方法（如CTAB法）以獲得純度較高的DNA模板。（1）PCR檢測 3）反應(yīng)體系的建立① ，分別加入轉(zhuǎn)基因植物總DNA、陰性對照植物總DNA、陽性對照DNA（含被檢基因的質(zhì)粒）為反應(yīng)模板。同時設(shè)置兩個空白對照即無DNA模板的對照和無引物的對照。② 依次加入反應(yīng)成分：（1）PCR檢測（1）PCR檢測l PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中含50mmol/LKCl、10mmol/L TrisHCl（）、。l ③ 預(yù)變性。將上述成分混勻后于94℃變性10min。取出離心管，臺式離心機(jī)上快速離心幾秒鐘，使冷凝于管蓋上的液體回到管底。l ④ 加入Taq DNA聚合酶，在預(yù)變性后的反應(yīng)成分混合液中加入1ulTaq DNA聚合酶（約1～3U），混勻。l ⑤ 最后加入1滴礦物油（約50ul）于管中，防止反應(yīng)循環(huán)中水分的蒸發(fā)。（1）PCR檢測4）循環(huán)參數(shù)的設(shè)定 ① 94～95℃變性30～60s。② 58～60℃退火1min (據(jù)各個引物最佳退火溫度調(diào)整)。③ 72℃延伸1～2min，循環(huán)25～40次（依不同基因預(yù)備試驗結(jié)果而定）。④ 72℃延伸7～10min。⑤ 循環(huán)終止。（1）PCR檢測5）電泳檢測① 取各樣品反應(yīng)物5～20ul點樣，%～2%瓊脂糖電泳分離，50～100V電泳1h。② 紫外燈下觀察結(jié)果并照相。如果有必要，可以把特異帶切下來，用同等的PCR反應(yīng)條件，適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體積進(jìn)行再擴(kuò)增。（2）Southern印跡雜交基本原理：l 將基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，堿處理使酶切片段在凝膠上原位變性。l 利用印跡技術(shù)將變性的酶切片段原位轉(zhuǎn)移到固相膜上，經(jīng)烘干或紫外線照射處理固定。l 預(yù)雜交處理掩蓋膜上的非特異性雜交位點。加入含有單鏈探針的雜交液，在適宜條件下雜交。l 膜上存在的與探針互補(bǔ)的單鏈序列，可提供堿基互補(bǔ)作用與探針雜交形成雙鏈，從而使探針固定在相應(yīng)的位置上，并根據(jù)探針的標(biāo)記性質(zhì)采用相應(yīng)的方法檢測出來，例如，若使用放射性標(biāo)記探針，則可通過放射性自顯影而被檢測出來。（2）Southern印跡雜交? 基本步驟： ①被檢植物的DNA提?。? ②雜交探針制備； ③DNA樣品酶切； ④電泳； ⑤變性； ⑥印跡； ⑦雜交； ⑧雜交結(jié)果的檢出。 外源基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測? （1） Northern雜交? （2）RTPCR等。? 二者都只能檢測目的基因是否表達(dá)，無法準(zhǔn)確測定RNA表達(dá)量，而且操作復(fù)雜。? （3）實時定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR），近年興起的核酸定量檢測技術(shù)，可較準(zhǔn)確地測定目的基因RNA表達(dá)量。Northern印跡雜交? 基本步驟： ①被檢植物的總RNA提取； ②探針制備； ③印跡； ④雜交； ⑤雜交結(jié)果檢出。 外源基因翻譯水平的檢測? （1） Gus檢測? （2） Western雜交? （3） ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)（1）Gus檢測? 基本原理：– gus基因 (β葡萄糖甘酸酶基因)是植物基因工程中應(yīng)用較為廣泛的報告基因，編碼β葡萄糖甘酸酶。– 該酶與5溴4氯3吲哚βD葡糖甘酸酯（簡寫XGluc）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀反應(yīng)。既可以用分光光度計法測定，又可以直接觀察到植物組織由沉淀形成的藍(lán)色斑點。– 檢測容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時間內(nèi)測定完畢。（1）Gus檢測? 基本步驟：（1）藥品配制（2）染色及觀察 第一步，將葉片、莖等植物材料制成徒手切片（1～3mm厚）或剪成小塊、小片。 第二布，染色、觀察。（1）Gus檢測直接染色法a) 將植物材料放入Eppendorf管中，加染液浸沒材料。b) 37℃水浴中浸育1h至過夜。c) 如有必要，可將浸染過的材料轉(zhuǎn)入70%或95%乙醇中脫色（除去葉綠素）2～3次，至陰性對照材料呈白色為止。也可在FAA固定脫色液中脫色。d) 肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍(lán)色沉淀小點即為GUS表達(dá)位點。（1）Gus檢測固定染色法a) 將材料浸入固定液，必要時可抽真空1min，室溫下輕搖30～60min。b) 取出材料，用磷酸鈉緩沖液漂洗3～4次。c) 取出材料放入Eppendorf管中，加入染色液浸沒材料，蓋上管蓋。d) 37℃溫箱中溫育幾分鐘至過夜。e) 取出材料，用75%乙醇漂洗，或放入FAA液中脫色20min。f) 依次用20%乙醇、50%乙醇浸泡材料各20min。g) 顯微鏡下觀察，白色背景下的藍(lán)色斑點極為Gus表達(dá)位點。h) 染色后的材料可浸入含80%乙醇的FAA液中保存。（2）Wester