【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 聚合酶可以在2min內(nèi)延伸10k的DNA片段，而一般的PfuDNA聚合酶相同時(shí)間下即使提高酶的用量也只能合成2k的DNA片段。同時(shí)，融合后DNA聚合酶與雙鏈DNA的作用是較弱的，這就避免了強(qiáng)相互作用所導(dǎo)致的阻礙DNA聚合酶在DNA鏈上移動(dòng)的不利結(jié)果。此外還發(fā)現(xiàn)Sso7d可以增加聚合酶對(duì)體系中高鹽濃度的耐受性，可便于對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化?！　∨cSso7d相類似，在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶V中發(fā)現(xiàn)的螺旋O發(fā)夾O螺旋結(jié)構(gòu)蛋白也是一種DNA非特異性結(jié)合蛋白[24]。它在中性pH的條件下部分帶正電，因此可以與帶負(fù)電的DNA磷酸骨架相互作用。Pavlov等[25]將它與PfuDNA聚合酶相融合后發(fā)現(xiàn)可以增加DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性、提高酶對(duì)高鹽濃度的耐受性，并增加酶的延伸活性。　　目前，商品化的快速PCR聚合酶主要是Takara公司的Taq聚合酶，該酶除了延伸速率提高之外，還可耐受更高的變性溫度，推薦98℃變性1s，因此變性階段的時(shí)間也縮短了不少。Machida等[26]在大批量樣本的擴(kuò)增中評(píng)價(jià)了快速Taq聚合酶，擴(kuò)增產(chǎn)物正常，但未與其它常規(guī)用Taq酶比較。在Qiu等[27]的工作中，評(píng)價(jià)了TaqDNA聚合酶、LA OTaqDNA聚合酶與AmpliTaqDNA聚合酶對(duì)PCR產(chǎn)物中嵌合體(chimeras)，突變(mutiation)和異源雙鏈( heterodup lex)的產(chǎn)生的影響。在其試驗(yàn)體系中ZOTaq具有最高的反應(yīng)速率，但形成PCR 假象( artifact)的總幾率較高，達(dá)20%；LAOTaq具有最高的保真度，反應(yīng)速率居中，形成PCR假象的總幾率為15%；AmpliTaq形成PCR假象的幾率為7%。ZOTaq (8. 7% )與LA OTaq ( 6. 2% )比Am pliTaq ( % )容易形成嵌合體。ZOTaq形成嵌合體和異源雙鏈的頻率比AmpliTaq高幾乎三倍。該工作提示利用ZOTaq酶快速擴(kuò)增的同時(shí)部分程度上犧牲了保真度。3 mRNA 差異顯示PCR技術(shù)3．1 mRNA差異顯示PCR技術(shù)的主要原理　　在生命過(guò)程的某一時(shí)期，生物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的基因只有很少一部分，而且在不同的發(fā)育階段、不同的生理狀態(tài)和不同類型細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)也不盡相同，因此，研究mRNA的差異，相對(duì)于研究DNA差異，排除了內(nèi)含子的影響，使研究更接近于生命活動(dòng)的實(shí)質(zhì)。mRNA差異顯示PCR技術(shù)是根據(jù)真核生物細(xì)胞中絕大多數(shù)mRNA均帶有3′polyA尾的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(除極少部分mRNA，如組蛋白mRNA外) 。以此為依據(jù)，設(shè)計(jì)3′端引物OligodTnM(M 分別代表A、C、G) ，這3種引物，稱之為錨錠引物[2829]。利用錨定引物將不同來(lái)源的細(xì)胞或不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞的mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用此引物和5′端的隨機(jī)引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，隨后進(jìn)行熒光染色或硝酸銀染色或放射自顯影，通過(guò)比較找出差異表達(dá)的cDNA條帶[30]。從凝膠上切割下這些差異性條帶，用相同的引物和條件進(jìn)行PCR再擴(kuò)增，克隆所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列分析，將分析結(jié)果與基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列作同源比較，就可知分離的是已知基因序列，還是未知基因序列；同時(shí)分析結(jié)果可以用作探針從cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)中篩選到全長(zhǎng)的cDNA序列或基因組克隆。3．2 差異顯示PCR技術(shù)應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)3．2．1 極少的總RNA的需要量　　差異顯示PCR技術(shù)總RNA需要量極少，～，在這一點(diǎn)上，是其他的差異表達(dá)研究方法無(wú)法比擬的，這種方法使得尤其對(duì)材料來(lái)源困難的生物體的差異表達(dá)的研究得以實(shí)現(xiàn)[5]。同時(shí)用純化的總RNA和純化的mRNA做模板都可以獲得相同差異表達(dá)結(jié)果，因?yàn)殄^定引物OligodTnM能特異性結(jié)合于mRNA的poly(A)尾部，而轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA的存在不影響差異顯示PCR的結(jié)果[31]。3. 2．2 敏感度高　　　其他研究差異表達(dá)的方法適用于高轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的差異比較，而低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的差異比較卻顯得無(wú)能為力。差異顯示PCR技術(shù)對(duì)于篩選低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的結(jié)果得到很大改善，使低轉(zhuǎn)錄水平mRNA進(jìn)行差異顯示PCR的可能性大大提高[3233]。3．2．1 操作簡(jiǎn)單快捷　　　差異顯示PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單快捷，從RNA的純化，差異顯示PCR、差異電泳、差異帶分離純化，差異鑒定、陽(yáng)性結(jié)果的序列分析，整個(gè)可以在2~3周完成，這是其他方法無(wú)法比擬的[6]。3．3 差異顯示PCR技術(shù)應(yīng)用中的不足　　雖然差異顯示PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于差異表達(dá)基因的研究，并且仍在不斷地優(yōu)化和改進(jìn)，但是，差異顯示PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題[31,3435]。3．3．1 假陽(yáng)性高　　　差異顯示PCR技術(shù)假陽(yáng)性差異帶過(guò)高，差異顯示PCR時(shí)的差異帶往往不能在Northern雜交和反向Northern雜交中重現(xiàn)。差異條帶經(jīng)回收后，必須再次擴(kuò)增才能用于Northern雜交、克隆及序列分析等，有時(shí)2次PCR反應(yīng)經(jīng)常擴(kuò)增出多條帶，影響隨后的雜交鑒定[34]。3．3．2 獲得的片段短　　　，差異顯示PCR所得cDNA片段的長(zhǎng)度多在100～400bp之間，平均長(zhǎng)度約300bp，這些片段大多數(shù)位于mRNA3′端300bp左右的非翻譯區(qū)，這段mRNA在不同生物間差別較大，基因文庫(kù)中常不包括這部分。差異顯示PCR的cDNA并不是都能找到與之同源的序列。另外，由于同一生物3′端的非翻譯區(qū)較為相似，對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序之后并不能預(yù)測(cè)其功能和作進(jìn)一步的分析。為了得到翻譯區(qū)的序列，常用的方法是篩選cDNA文庫(kù)或者應(yīng)用RACE方法獲取全基因，但篩選cDNA文庫(kù)非常耗時(shí)，并且同一物種，不同的基因3′端的非翻譯區(qū)非常相似，篩庫(kù)工作很可能是徒勞的[35]。3．3．3 稀有mRNA差異顯示困難　　　PCR高度靈敏，易擴(kuò)增展示稀有mRNA片段，這既是該方法的優(yōu)點(diǎn)，也是該方法的不足之處，因?yàn)橄∮械膍RNA在雜交時(shí)顯示不出表達(dá)信號(hào)。因此，該方法傾向于分離高拷貝數(shù)的cDNA序列，如何提高分離稀有mRNA效率有待進(jìn)一步的研究[31]。3 小結(jié)與展望　　基因分析的定量化是對(duì)基因診斷的要求和未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)?？偟膩?lái)說(shuō)，定量PCR技術(shù)的研究方興未艾，還有諸多問(wèn)題有待解決，如競(jìng)爭(zhēng)性PCR中競(jìng)爭(zhēng)性模板制備較難，且與待測(cè)模板的擴(kuò)增效率也難以達(dá)到完全相同；Taqman技術(shù)中Taq酶的外切酶活性能影響定量；AmpliSensor技術(shù)仍無(wú)法區(qū)分引物二聚體形成的非特異擴(kuò)增信號(hào)，且每次PCR反應(yīng)前需進(jìn)行AmpliSensor標(biāo)記，增加了操作步驟及成本；分子信標(biāo)技術(shù)所用探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定性還不理想；以及Lightcycler技術(shù)因兩個(gè)探針均與模板結(jié)合而影響了擴(kuò)增效率等；此外，熒光定量PCR技術(shù)均存在探針標(biāo)記的成本較高，不便普及的問(wèn)題，分析靈敏度仍需不斷提高。以上表明對(duì)定量PCR技術(shù)的研究還需不斷深入。相信在不久的將來(lái)，會(huì)有結(jié)果更精確、成本更低的定量PCR技術(shù)出現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)研究及臨床診斷上得到廣泛的應(yīng)用?！　CR技術(shù)總體來(lái)講已經(jīng)成為一個(gè)較為成熟的技術(shù)，但隨著研究和應(yīng)用領(lǐng)域不斷增長(zhǎng)的新需求，PCR仍存在相當(dāng)巨大的改進(jìn)空間。這其中，快速PCR技術(shù)的探索無(wú)疑是一項(xiàng)重要的拓展工作。如上所述，通過(guò)提高酶的活性、加入適合的添加劑以及對(duì)熱循環(huán)儀中使用的溫度改變方式進(jìn)行改進(jìn)，已經(jīng)從不同程度上實(shí)現(xiàn)了快速PCR。如果能將三者的優(yōu)勢(shì)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，則擴(kuò)增速度有望進(jìn)一步提高我們認(rèn)為，針對(duì)該技術(shù)的面向普及應(yīng)用的評(píng)價(jià)仍需深入，在實(shí)際使用過(guò)程中也不能單純盲目地求快，而應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究對(duì)象的不同，在保證PCR反應(yīng)的特異性、靈敏