共聚焦課件無(wú)圖(編輯修改稿)
2025-04-18 05:15 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 述 二 .影響共聚焦檢測(cè)質(zhì)量的主要設(shè)備參數(shù) 三 .因樣本的處理不當(dāng)影響共聚焦檢測(cè)質(zhì)量的 因素 四 .樣本制作過(guò)程需要注意的問(wèn)題 16 熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有： 。 ：孵育的時(shí)間 、 溫度不當(dāng) ， 大多數(shù)情況下都是樣品與探針?lè)跤郎囟忍突驎r(shí)間太短造成 。 。 這是一種很常見(jiàn)的標(biāo)記失敗原因 。 熒光探針一般要低溫保存 、 不要反復(fù)凍溶 、 應(yīng)用液現(xiàn)用現(xiàn)配制 ，另外其要在保質(zhì)期內(nèi)使用 。 17 熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有： 、 pH值不適當(dāng) 。 例如 FITC：在 pH68時(shí) ， 很難跨過(guò)完整的活細(xì)胞膜使之染色 ， 但在 。 pH為 9時(shí) ， 可以跨膜進(jìn)入細(xì)胞 。 。 例如 ， 有一些探針只標(biāo)記活細(xì)胞 ， 如果細(xì)胞活性不夠則難以標(biāo)記上熒光 。 。 雖然加入溶液的探針量足夠 ， 但探針沒(méi)有完全溶解 ， 因此 ， 實(shí)際接觸細(xì)胞的探針濃度很低 。 18 熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有： 。 例如 ， 用可透細(xì)胞膜的探針 FDA標(biāo)記細(xì)胞后 ， 應(yīng)在40分鐘內(nèi)測(cè)定 ， 否則其從進(jìn)人開(kāi)始 ， 120分鐘后 ， 其熒光就只剩下約 10％ ， 細(xì)胞內(nèi)的熒光探針會(huì)大部分泄漏到細(xì)胞外 。 。 探針的化學(xué)形式直接影響標(biāo)記的結(jié)果 。 例如標(biāo)記活細(xì)胞 Ca2+， 使用 nu03熒光探針時(shí) ， 其有兩種形式 ，F(xiàn)luo3 AM和 Fluo3；直接與活細(xì)胞共孵育標(biāo)記時(shí) ， 要用熒光探針的跨膜形式 Fluo3AM， 而不能用 Fluo3， 后者可用顯微注射等方式導(dǎo)入細(xì)胞 。 而 Fura2采用雙波長(zhǎng)檢測(cè) （ 比率法 ） ， Fluo3是單波長(zhǎng)檢測(cè) ， Fura2的激發(fā)波長(zhǎng)是 340nm和 380nm， 發(fā)射波長(zhǎng)為 510nm。 Fluo3的激發(fā)波長(zhǎng)是 506nm， 最大發(fā)射波長(zhǎng)為 526nm。Fura2可以采用流式細(xì)胞儀檢測(cè) ， Fluo3一般采用激光管聚焦或熒光顯微鏡檢測(cè) 。 19 熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有： 。 樣品中的自發(fā)熒光光譜范圍很寬 ， 有時(shí)會(huì)干擾正常細(xì)胞染色 ， 例如 ， 葉綠素的自發(fā)熒光光譜范圍很寬且強(qiáng)度高 ， 會(huì)覆蓋某些紅 、 黃 、 綠色熒光 。 ， 例如 。 FITC的
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