【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 例： L乳酸脫氫酶， 作用于 L乳酸 基因工程研究所 肖維威 （三） 酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性 ?對(duì)酶生成與降解 量的調(diào)節(jié) ?酶催化效力的調(diào)節(jié) （活性的調(diào)節(jié)） 酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機(jī)體對(duì)不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動(dòng)的需要。 基因工程研究所 肖維威 （一） 決定酶高效性的作用機(jī)制 —— 二、酶促反應(yīng)的機(jī)制 降低反應(yīng)的活化能 基因工程研究所 肖維威 ? 1. 鄰近效應(yīng) (proximity effect) 與定向排列 (orientation arrange ) 決定酶高效性的其它作用機(jī)制 ? 2. 表面效應(yīng) (surface effect) ? 3. 多元催化 (multielement catalysis) 基因工程研究所 肖維威 （二） 決定酶特異性的作用機(jī)制 —— ? Lock and key model —— 1890 by Emil Fischer 基因工程研究所 肖維威 ? Induced fit model —— 1958 by Daniel Koshland 基因工程研究所 肖維威 *誘導(dǎo)契合假說(shuō) (inducedfit hypothesis) 酶分子構(gòu)象與作用物結(jié)構(gòu)并不一定完全吻合，而是當(dāng)兩者在相互接近時(shí)，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。這一過(guò)程稱為酶 底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說(shuō) 。 基因工程研究所 肖維威 誘導(dǎo)契合假說(shuō) 基因工程研究所 肖維威 ? 酶促反應(yīng)的特點(diǎn) – 高效性 – 高度特異性 – 可調(diào)節(jié)性 ? 酶促反應(yīng)的機(jī)制 – 酶高效性作用機(jī)制 — 降低反應(yīng)活化能 – 酶特異性作用機(jī)制 誘導(dǎo)契合假說(shuō) 第二節(jié) 酶的工作原理 基因工程研究所 肖維威 第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) Kiics of EnzymeCatalyzed Reaction 基因工程研究所 肖維威 ? 影響因素包括有： ? 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 研究 各種因素 對(duì) 酶促反應(yīng)速度 的影響 底物濃度 酶濃度 pH 溫度 抑制劑 激活劑 基因工程研究所 肖維威 ?酶促反應(yīng)速度的測(cè)定： 用單位時(shí)間內(nèi)底物(substrate)減少或產(chǎn)物增加的量來(lái)表示 。 ?反應(yīng)速度取其初速度 ， 即底物的消耗量很小 （ 一般在 5﹪ 以內(nèi) ） 時(shí)的反應(yīng)速度 。 ? 研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定。 基因工程研究所 肖維威 Vmax V [S] Km Vmax/2 矩形雙曲線關(guān)系 一、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 基因工程研究所 肖維威 當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí) 反應(yīng)速度與底物濃度成正比 V [S] Vmax 基因工程研究所 肖維威 隨著底物濃度的增高 反應(yīng)速度不再成正比例加速 V [S] Vmax 基因工程研究所 肖維威 當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度 反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度 V [S] Vmax 基因工程研究所 肖維威 酶促反應(yīng)模式 —— 中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō) E + S k1 k2 k3 ES E + P ES: 酶 底物復(fù)合物 中間產(chǎn)物 基因工程研究所 肖維威 ※ 1913年 Michaelis和 Menten推導(dǎo)出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式 ， 即米－曼氏方程式 ， 簡(jiǎn)稱 米氏方程式 。 （一）米－曼氏方程式 [S]： 底物濃度 V： 不同 [S]時(shí)的反應(yīng)速度 Vmax： 最大反應(yīng)速度 (maximum velocity) Ｋ m： 米氏常數(shù) (Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── 基因工程研究所 肖維威 米－曼氏方程式推導(dǎo)過(guò)程： ES的生成速率 = ES的分解速率 (1) = ([E]－ [ES])[S] k2+k3 [ES] k1 整理得： k1 ([E]－ [ES]) [S] = k2 [ES] + k3 [ES] ?當(dāng)反應(yīng)處于穩(wěn)態(tài)時(shí)： k1 [游離酶 ] [S] = k2 [ES] + k3 [ES] k2+k3 = Km （米氏常數(shù) ） k1 令： 則 (1)變?yōu)?: ([E]－ [ES]) [S] = Km [ES] （米氏常數(shù) ）令：則 －）則 －當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時(shí)，即 [E] =[ES]，反應(yīng)達(dá)最大速率 Vmax = k3[ES] = k3[E] (4) [ES] = ─── [E][S] Km + [S] (2) 整理得 : 將 (4)代入 (3)得米氏方程式： Vmax [S] Km + [S] V = ──── V = k3[ES]得 k3[E][S] Km + [S] (3) V = ──── 當(dāng) [S] Km時(shí)， V= Vmax [S]/ Km，反應(yīng)速度與 [S] 呈正比。 當(dāng) [S] Km時(shí)， V≌ Vmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度， [S]再增高也不影響反應(yīng)速度 。 Vmax V [S] Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── Km值的意義 ① Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是 mol/L 。 當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí) Vmax V [S] Km Vmax/2 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Km＝ [S] （二） Km與 Vmax的意義 基因工程研究所 肖維威 ② Km值是酶的特征性常數(shù)之一 a) 只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與其濃度無(wú)關(guān) b) 不同的酶，其 Km值不同，測(cè)定 Km可以 作為 鑒別酶 的一種手段 c) Km值： 106~102mol/L 基因工程研究所 肖維威 ③ Km可反應(yīng)酶對(duì)底物的親和力 Km值愈 小 ，酶對(duì)底物的親和力愈 大 Km值愈 大 ，酶對(duì)底物的親和力愈 小 一種酶有幾種不同的 Km值時(shí)， Km值最小的底物是天然底物或是 最適底物 。 基因工程研究所 肖維威 某些酶的 Km值 酶名稱 底物 Km（ mmol/L） 過(guò)氧化氫酶 H2O2 25 碳酸酐酶 H2CO3 9 胰糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108 β半乳糖苷酶 D乳糖 己糖激酶 D果糖 D葡萄糖 基因工程研究所 肖維威 Vmax的意義 定義： Vmax是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。 Vmax =k3 [E] 意義： 如果酶的總濃度已知，可從 Vmax計(jì)算 酶的轉(zhuǎn)換數(shù) (turnover number) ，即動(dòng)力學(xué)常數(shù) k3。 基因工程研究所 肖維威 酶 底 物 轉(zhuǎn)換數(shù) （ s?1） 過(guò)氧化氫酶 H2O2 40 000 000 碳酸酐酶 HCO3? 400 000 乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿 14 000 ?內(nèi)酰胺酶 芐青霉素 2 000 延胡索酸酶 延胡索酸 800 Rec A蛋白 ATP 一些酶的轉(zhuǎn)換數(shù) 基因工程研究所 肖維威 Km值與米氏方程的應(yīng)用 —— 計(jì)算底物濃度和相對(duì)速度 ? 可由所要求的反應(yīng)速度 (應(yīng)到達(dá) Vmax的百分?jǐn)?shù) )，求出應(yīng)當(dāng)加入底物的合理濃度。 ? 反過(guò)來(lái)，也可以根據(jù)已知的底物濃度，求出該條件下的反應(yīng)速度。 1. 雙倒數(shù)作圖法 (double reciprocal plot)，又稱為 林 貝氏 (Lineweaver Burk)作圖法 Vmax[S] Km+[S] V = （林－貝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 兩邊同取倒數(shù) 1 Vmax Km Vmax 斜率＝ 1 Km － 0 1 V 1 [S] （三）Ｋ m值與Ｖ max值的測(cè)定 4 2 0 2 4 6 8 100. 00. 20. 40. 60. 81. 01/ [S] (1/ m m ol .L1)1/v1/Km 1/Vmax Km /Vmax 2. Hanes作圖法 [S] [S]/V Km 1/Vmax (斜率） 在林－貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘 [S] + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] [S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax 兩邊同乘 [S] ? 當(dāng) [S]＞＞ [E]， 酶可被底物飽和的情況下 ， 反應(yīng)速度與酶濃度 成正比 。 ? 關(guān)系式為： V = K3 [E] 0 V [E] 當(dāng) [S][E]時(shí)， Vmax = k3 [E] 酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 二、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 ?雙重影響 ?最適溫度 (optimum temperature)： 酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。 ?低溫的應(yīng)用 : 臨床低溫麻醉 低溫保存菌種 酶 活 性 0 10 20 30 40 50 60 溫度 186。C 溫度對(duì)淀粉酶活性的影響 三、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響 ?最適 pH (optimum pH)： 酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境 pH。 6 10 pH 最適 pH 酶 活 性 pH與酶活性的關(guān)系 四、 pH對(duì)反應(yīng)速度的影響 基因工程研究所 肖維威 人體部分酶的最適 pH 值 酶 最適 pH 胃蛋白酶 過(guò)氧化氫酶