[理化生]第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定(編輯修改稿)
2025-03-17 17:08 本頁面
【文章內容簡介】 特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用 水楊酸固定硝態(tài)氮化合物 ，用開氏分解測定總氮量 。同時用 其他方法 測定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質換算系數(shù)即得蛋白質含量。 注意問題 ? 本法測定的結果為 粗蛋白質 的含量。 ? 如要測定純蛋白質的含量，則樣品應先用蛋白質沉淀劑堿性硫酸銅、堿性醋酸鉛、 200gL1 ~ 250gL1單寧或 100gL1三氯乙酸等處理，將蛋白質從水溶液中沉淀出來，再測定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質的換算系數(shù)即可得：“ 純蛋白質 ”量。 注意問題 方法原理 蛋白質中的 堿性氨基酸 (賴氨酸、精氨酸和組氨酸 )的 NH咪唑基和胍基以及蛋白質末端自由氨基 在 pH=2～ 3的酸性緩沖液體系中呈 陽離子狀態(tài) 存在，可以和 偶氮磺酸染料類 物質如 橘黃 G等的陰離子結合，形成 不溶于水的蛋白質 染料絡合物 而沉淀下來，通過測定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結合量，即每克樣品所結合的染料的毫克數(shù)。 二、同類種子中蛋白質的測定 (染料結合 DBC法 ) ? 主要儀器 ? 試劑 ? 操作步驟 ? 結果計算 ? 參見教材 P286 二、同類種子中蛋白質的測定 (染料結合 DBC法 ) ? 該法是 間接測定 種子中蛋白質的方法。方法簡單、快速，與開氏法的相關性較好，但 準確性較差 ，適用于大批同類樣品的篩選工作。 ? 不適用 隨意混合物的樣品的測定 。 ? 如在 篩選同種作物種子 的大批樣品時，不必知道蛋白質的絕對含量，只要測定樣品的染料結合量即可進行比較。 注意問題 方法原理 ? 蛋白質的 肽鍵 結構，具有類似于雙縮脲的反應基團。在堿性條件下能與 Cu2+生成 紫紅色可溶性絡合物 ，蛋白質含肽鍵多時反應呈紫色，反之肽鍵少時，反應呈紅色。這種顏色反應稱為雙縮脲反應 (或稱縮二脲反應 )。 ? 實驗證明，蛋白質溶液濃度在 115mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質含量成正比關系。故可用此反應進行蛋白質的測定。 三、同類種子中蛋白質的測定 (雙縮脲法 ) ?樣品處理與測定 參見教材 P289。 三、同類種子中蛋白質的測定 (雙縮脲法 ) ? 適用于 大批品種篩選、育種 等工作中的蛋白質測定。 ? 一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是 堿性硫酸銅水溶液 ，不適用于種子蛋白質的分析，因為它不穩(wěn)定，而且會浸出有色物質、脂肪及一些淀粉物質，干擾比色測定。而 異丙醇雙縮脲試劑 ，可以減少這些物質的溶解， 排除干擾 。 ? 本法對 溫度及時間 的要求嚴格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫 2025℃ ，須于 120～ 190min內比色； 40℃ 為 1570 min顯色穩(wěn)定；而在 60℃ 連續(xù)振蕩條件下顯色，則反應時間縮短為 5min。 注意問題 第三節(jié) 氨基酸的測定 ? 氨基酸分析方法包括測定氨基酸的 總含量 及測定全氨基酸中 每種氨基酸 的含量兩個方面。 ? 測定氨基酸總量的方法與蛋白質分析有密切的關系。許多測定蛋白質含氮含量的方法如開氏定氮法及各種比色法均可用于測定氨基酸的總含量。 ? 測定氨基酸總含量的方法還有 甲醛滴定法 ，方法簡單，快速，廣泛應用于實際工作中。 ? 全氨基酸： 色譜法測定 。 ? 薄層層析色譜法： 60年代發(fā)展起來的分析方法，操作簡便，設備簡單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應用于
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