【文章內(nèi)容簡介】 紅的培養(yǎng)基。 如何用臺盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？ 用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。 室溫下配制的TrisHCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？ 緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM TrisHC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值。 50mM TrisHC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值 4176。C 25176。C 37176。C 如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？ 我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法，此技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。 胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞： 1. 去除培養(yǎng)基。 2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。 3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。 4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。 5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。） 6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。 7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。 , Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？ 為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。 在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？ 通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫? 這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基1015分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。 細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？ 如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？ 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？ 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。 培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？ 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液? 胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。 保存血清最好的方法? 我們建議血清應(yīng)保存在5℃至2O℃。若存放于4℃時(shí)，請勿超過一個(gè)月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損? 將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理? 血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。 若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙枞^濾膜。 為什么要熱滅活血清? 加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 有必要做熱滅活嗎? 實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。 若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量! 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀? 有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預(yù)老化，儲存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。 如何避免沉淀物的產(chǎn)生? 我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作: (1)解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。 (2)解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。 (3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。 (4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。 (5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。（三）、牛血清的質(zhì)量要求和制備技術(shù)工藝牛血清質(zhì)量在細(xì)胞培養(yǎng)中的重要性生物技術(shù)已經(jīng)被世界各國視為一種高技術(shù)，在整個(gè)科學(xué)技術(shù)中占據(jù)了特殊的顯著地位，特別是生命科學(xué)的發(fā)展更離不生物技術(shù)，生命科學(xué)的發(fā)展備受各國的重視。我國在很多大學(xué)中都設(shè)立了生命科學(xué)院?，F(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細(xì)胞作為載體；細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細(xì)胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)過程才能實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)?？傊?xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵