沉淀技術教學課件ppt(編輯修改稿)
2025-02-16 08:04 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 32 ? 硫酸銨 鹽使用前處理 重金屬離子對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，硫酸銨中常含有少量重金屬離子，所以要進行預處理。 硫酸銨使用時要求純度較高，生產(chǎn)時為降低成本，一般選用化學純的硫酸銨，在使用前應進行預處理，可通過化學法將重金屬除去（如通入 H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。 1）加入沉淀劑 優(yōu)級純 ≥ % 分析純 ≥ % 化學純 ≥ % 33 加鹽的方法 （ 1） .固體硫酸銨加入法 （需要量大時）。 將其研成細粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質(zhì)沉淀。 特定溫度下，各種不同飽和度應加入的硫酸銨的量可以從下表查出。 34 25℃ 調(diào)整硫酸銨飽和度查詢表 35 2） . 加入飽和硫酸銨溶液法（需要量小時）。 取過量硫酸銨加熱溶解，在 0℃ 或室溫放置，直至固體析出，得到飽和溶液，飽和度調(diào)整計算公式 V=V0 (S2— S1)/(1— S2) V為應加入飽和硫酸銨溶液的體積， V0 是蛋白質(zhì)溶液的原始體積， S2是所要達到的硫酸銨飽和度， S1 原來溶液的硫酸銨飽和度。 36 飽和溶液加入法是指將預先調(diào)好 pH的飽和硫酸銨溶液逐步加至相應的蛋白質(zhì)溶液中，使其達到一定的硫酸銨濃度（或飽和度），令蛋白質(zhì)沉淀下來。 適用范圍： 適用于飽和度不高，原來溶液體積不大的情況，如果加入飽和溶液后，體積過大，應改用固體加入法為好。 注意： 加入飽和溶液時，應邊攪拌邊少量分批緩慢加入，防止局部濃度過高，影響分離效果。 37 3） . 透析平衡法 將要鹽析的樣品臵于透析袋中，浸入飽和硫酸銨溶液中透析，透析袋中硫酸銨飽和度逐步提高，達到一定飽和度后，目的蛋白質(zhì)析出，停止透析。 特點：硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)繁瑣，要不斷測量飽和度，所以多用于結(jié)晶。 （ 2）沉淀物的陳化 38 高分子溶液在防止過程中自發(fā)的聚集而沉淀的現(xiàn)象稱為 陳化現(xiàn)象 。 為了提高鹽析的效率，鹽析后一般需放臵 ，待沉淀完全后才可以過濾離心，過早的分離將影響收率。 39 （ 3） 離心或過濾，收集 沉淀物 ?對于高濃度的硫酸銨溶液一般采用過濾的方法，因為離心要較高的轉(zhuǎn)速的時間。 ?對于低濃度的硫酸銨溶液則多采用離心的方法。 40 鹽析后處理工作 —— 脫鹽 由于鹽析沉淀產(chǎn)物中含鹽量較高，所以通過鹽析法得到蛋白質(zhì)后需要經(jīng)過脫鹽處理。 脫鹽最常用的方法：透析法。 原理：大分子不能透過半透膜，小分子例如無機鹽、單糖，可以透過膜擴散到水或緩沖液中。 所以采用半透膜作為透析膜，逐步更換低鹽緩沖液可以達到脫鹽效果。 透析 over 41 42 第二節(jié) 有機溶劑沉淀法 有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一， 常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等 定義： 向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機溶劑沉淀法。 43 （ 1） 靜電作用 降低水溶液的介電常數(shù) ，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，帶電的蛋白質(zhì)溶質(zhì)分子之間相互作用增強，使其相互吸引而聚集，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 原理 介電常數(shù) 表征的是電介質(zhì)的束縛電荷的能力，極性越大，介電常數(shù)越大。 44 （ 2）脫水作用 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。 較靜電作用占更主要的地位。 有機溶劑的選擇 1. 能夠與水互溶； 2. 極性應該比較小，這樣才能有效降低溶液的極性； 3. 致變性作用要小，保護目標產(chǎn)物的活性； 4. 毒性要小揮發(fā)適中。 45 46 使用較多的有機溶劑：乙醇、甲醇、丙酮。 乙醇常用于核酸、糖、氨基酸等物質(zhì)的沉淀； 乙醇、甲醇、丙酮常用于蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)的沉淀。 由于甲醇、丙酮對人體有一定的毒性，限制了有機溶劑法的適用范圍，所以不如鹽析法使用普遍。 進行沉淀操作，要使溶液達到一定的有機溶劑濃度，需要加入的有機溶劑的濃度和體積計算： V=V0 (S2— S1)/(100— S2) ? V為需加入 100%濃度有機溶劑的體積， ? V0 是原溶液體積， ? S2是所要達到的有機溶劑的濃度，
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