植物原生質體培養(yǎng)與體細胞雜交(編輯修改稿)
2025-02-15 00:36 本頁面
【文章內容簡介】 養(yǎng)基 （二） 滲透壓 （三） 植物激素 （四） 氮源 （五） 復雜有機物 二、 培養(yǎng)方法 三、 培養(yǎng)密度 四、 培養(yǎng)條件 （一）基本培養(yǎng)基 所使用的培養(yǎng)基一般是改良的細胞培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基的基礎成分多采用 B5或 MS培養(yǎng)基的配方。如 KM8P和 K8P培養(yǎng)基： 以 B5培養(yǎng)基為基礎 NT培養(yǎng)基： 以 MS培養(yǎng)基為基礎 不同植物常采用的培養(yǎng)基 禾本科植物： MS、 N KM； 十字花科和豆科： B KM8P、 K8P、 KM； 茄科： MS、 NT、 K3 （二）滲透壓 原生質體再生細胞壁之前，必須在培養(yǎng)過程中提供適宜的滲透壓保護。 在原生質體培養(yǎng)中，一般常用的滲壓劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麥芽糖等。 在原生質體培養(yǎng)中不宜使用電解質滲壓劑。 原生質體再生細胞壁后應使培養(yǎng)基的滲透壓逐步降低。 （三）植物激素 不同植物原生質體培養(yǎng)對激素的種類和濃度的要求 存在較大的差異 。 生長素中常用的是 2,4D、 NAA，在細胞分裂素中最常用的是 BAP、 KT、 2IP。 在不同的生長發(fā)育階段（起始分裂、細胞團形成、愈傷組織形成與器官分化、胚狀體發(fā)生與成苗），需要不斷對培養(yǎng)基中激素的種類和濃度進行適時調整。 （ 1）在原生質體培養(yǎng)中，加入 2,4D對于原生質體再生細胞壁，啟動分裂，持續(xù)分裂直至形成愈傷組織是很有效的，如禾谷類植物。 （ 2）一般細胞分裂素和生長素以一定配比結合使用。 （ 3）由活躍生長的培養(yǎng)細胞分離的原生質體要求較高的生長素 /分裂素配比才能進行分裂； 由高度分化的細胞如葉肉細胞得到的原生質體，常需要較高的分裂素 /生長素配比才能進行脫分化。 （四）氮源 許多研究指出，適當濃度的谷氨酰胺對原生質體的細胞壁再生、細胞分裂和生長都有明顯的作用。 NH4+濃度太高的培養(yǎng)基不宜用作原生質體培養(yǎng)基。銨對許多植物（如煙草、馬鈴薯）的原生質體有毒害作用，抑制原生質體的生長。降低培養(yǎng)基中NH4+濃度對原生質體的存活、細胞再生及持續(xù)分裂都有利。 還有很多實驗發(fā)現(xiàn)硝酸鹽對原生質體可產(chǎn)生毒害作用，因此使用時應特別注意其用量。 （五）復雜有機物 在原生質體培養(yǎng)中，常加入一些復雜有機物，可以不同程度的提高再生細胞分裂頻率，促進細胞團的形成。 常用的有機物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。 二、 培養(yǎng)方法 ?原生質體培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng)的方法， 因為 ： （一） 液體淺層培養(yǎng) （二） 平板法培養(yǎng) （三） 懸滴法培養(yǎng) （四） 固液結合培養(yǎng)法 原生質體培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng) 有些物種的原生質體不能在固體培養(yǎng)基上分裂。 采用液體培養(yǎng)有利于調整培養(yǎng)基成分。 采用液體培養(yǎng)可將經(jīng)過幾天高密度培養(yǎng)之后的細胞密度降低，也可將感興趣的細胞分離出來。 （一）液體淺層培養(yǎng) 方法 把原生質體以一定的密度（ 約 2 105個 /mL）懸浮在液體淺層培養(yǎng)基中（淺層的厚度以 1mm為宜），用石蠟膜封住平皿后，放在適宜條件下培養(yǎng)。 優(yōu)劣 優(yōu)點是 ：操作方便，對原生質體的傷害也??；培養(yǎng)基與空氣接觸面大、通氣好；原生質體的代謝物易擴散，防止了有害物質積累過多而造成毒害；便于轉移培養(yǎng)物或添加新鮮培養(yǎng)基。 缺點是 ：原生質體分布不均，易造成局部密度過高或原生質體粘聚而影響其再生細胞的分裂和進一步的生長發(fā)育；難以實施定點觀察和跟蹤觀察。 （二）平板法培養(yǎng) 方法 取適量原生質體懸浮液，與熱融并冷卻至 45℃ 的含瓊脂或瓊脂糖的培養(yǎng)基等量混合，并迅速輕輕搖動，使原生質體均勻分布。待凝固后，將培養(yǎng)容器置于四周墊有保濕材料的容器內。 優(yōu)劣 ?有利于原生質體均勻分布； ?便于定點觀察，可跟蹤觀察單個原生質體的細胞壁再生、分裂等行為； ?也有利于在部分材料污染時搶救未污染的部分。 （三）懸滴法培養(yǎng) 方法 將適宜密度的原生質體懸浮液，用滴管或定量加液器，以 50ul/100ul的小滴接種于培養(yǎng)皿蓋內，其數(shù)量以滴與滴間不相碰為原則，皿底加入液體以保濕。將皿蓋穩(wěn)妥地蓋在皿底上，封口培養(yǎng)。 優(yōu)劣 優(yōu)點是 ：所用材料較少，培養(yǎng)液用量也少；有利于通氣和觀察， 易添加培養(yǎng)基；不易污染等。適合低密度培養(yǎng)。 缺點是 ：原生質體分布不均，易集中于小滴中央；液滴與空氣接觸面大，培養(yǎng)基成分和物理特性易于變動。 （四）固液結合培養(yǎng)法 雙層培養(yǎng)法 在培養(yǎng)皿底先鋪一
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