【文章內(nèi)容簡介】 、谷胱甘肽S轉移酶（GST）等，非酶促反應體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質(zhì)。例如：VE、胡蘿卜素、VC、半胱氨酸、乳鐵蛋白等。這個體系的防護氧化作用主要通過三條途徑：（1）消除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過氧化：（2）分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；（3）除去起催化作用的金屬離子。防御體系各成分之間相互起到了協(xié)同作用，以及代償作用與依賴作用[14]。堿性磷酸酶（AKP）是動物代謝過程中重要的調(diào)控酶，能夠將對應底物去磷酸化，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團的過程被稱為去磷酸化或脫磷酸化。它是一種非特異性磷酸水解酶，磷酸酶的作用與激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，將磷酸基團加到對應底物分子上[15]。AKP能催化磷酸單脂的水解及磷酸基團的轉移反應，對動物的生存具有重要的意義[16]。 本試驗的目的及意義近十多年來，國內(nèi)外對多種有機錫化合物對哺乳動物免疫系統(tǒng)的影響有很多研究[17]。Thayser(1984)最早報道有機錫化合物對哺乳動物免疫系統(tǒng)有抑制作用[18]。Sherman等（1988）發(fā)現(xiàn)高劑量三丁基錫和二丁基錫化合物引起小鼠胸腺和脾臟萎縮，小鼠體重降低；低劑量TBT對淋巴細胞功能也有抑制作用[19]。Annanie等（1988）報道TBT對小鼠免疫系統(tǒng)的影響，并發(fā)現(xiàn)氯化二丁基錫影響最大[20]。關于有機錫化合物對哺乳動物生殖系統(tǒng)影響的研究很少，只有Alam等（1993）報道過DBTL（二月桂酸二丁基錫）對大鼠繁殖的影響，而對哺乳動物精子影響未見報道[21]。有資料表明，由于環(huán)境污染，人類的精子質(zhì)量明顯下降[22,23]。但是對于環(huán)境水平下的TPT含量對雄性哺乳動物生殖的影響及機制還沒有比較全面的研究報道。本試驗以青春期SD大鼠作為研究對象，采用低水平（、50 μg/kg）的TPT灌胃染毒，進行54 d的暴露，稱量每只大鼠的體重、睪丸和附睪重量并計算睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)，精子涂片觀察附睪內(nèi)精子形態(tài)并計算畸形率，采用石蠟切片和HE染色的方法觀察睪丸和附睪組織學變化，用分光光度法測定睪丸中堿性磷酸酶（AKP）、總抗氧化能力（TAOC）和γ谷氨酰轉肽酶（γGT）水平；以初步探討TPT對雄性大鼠生殖機能的影響及其生殖毒性的作用機理，為分析預測環(huán)境TPT污染對動物以及人類健康的影響提供依據(jù)。2 材料與方法 實驗動物及分組處理選健康的SPF級青春期SD大鼠20只（鄭州大學試驗中心提供），隨機分為4組：3個不同劑量(、50 μg/kg)的處理組和對照組，每組5只。各TPT處理組均用配好的濃度液灌胃，對照組給予等量溶劑（生理鹽水和無水乙醇），每3日1次，暴露54 d。末次染毒24 h后用10%的水合氯醛麻醉動物，眼眶采血后處死，取雙側睪丸，稱重，分別進行睪丸的形態(tài)學觀察。將一側睪丸和附睪放入多聚甲醛固定液中固定，另一側睪丸和附睪放入20℃冰箱中凍存用于標志性酶活性的測定。 試驗儀器與試劑；蘇木精，分析純（AR），購于成都市科龍化工試劑廠，批號：20080725；伊紅，分析純（AR），購于天津市津科精細化工研究所，批號：20080727；二甲苯，分析純（AR），購于煙臺市雙雙化工有限公司，批號：20111116；無水乙醇，分析純（AR），購于天津市凱通化學試劑有限公司，批號：2012415；氯化鈉（AR）,購于天津市凱通化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉（AR）, 購于天津市凱通化學試劑有限公司。磷酸氫二鈉（AR），購于天津市凱通化學試劑有限公司；中性樹膠，購于上海標本模型廠，批號：20080109；即用型SABC免疫組化染色試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司；多聚賴氨酸，購于武漢博士德生物工程有限公司；雄激素受體，購于武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。2021 型手搖式組織切片機、Olympus BH1 型顯微鏡、MIE顯微圖像處理軟件（購于山東易創(chuàng)電子有限公司）、101型電熱恒溫干燥箱、電子萬用爐，單孔二列電熱恒溫水浴鍋、電子天平、移液槍、烤片臺等。 檢測項目及方法石蠟切片制作：取多聚甲醛固定的組織，修塊后流水沖洗過夜——75%乙醇（2h）——80%乙醇（3 h）——90%乙醇（2 h）——95%乙醇Ⅰ（1 h）——95%乙醇Ⅱ（1 h）——100%乙醇Ⅰ（1 h）——100%乙醇Ⅱ（30 min）——二甲苯（觀察透明效果）——蠟Ⅰ（1 h）——蠟Ⅱ（30 min）——包埋。HE染色：二甲苯Ⅰ種脫蠟10 min——二甲苯Ⅱ中脫蠟5 min——100%酒精Ⅰ中脫二甲苯5min——100%酒精Ⅱ中脫二甲苯5 min——95%酒精中5 min——85%酒精中5 min——75%酒精中5 min——蒸餾水中洗3 min——蘇木素染色5 min——流水沖洗5 min——%鹽酸分化20~40 s——流水沖洗5 min————流水沖洗5~10 min——鏡檢著色滿意后放入蒸餾水清洗——70%酒精5 min——85%酒精5 min——伊紅染色2~3 min——95%酒精Ⅰ5 min——95%酒精Ⅱ5 min——100%酒精Ⅰ中10 min——100%酒精Ⅱ中5 min——二甲苯Ⅰ中10 min——二甲苯Ⅱ中10 min——中性樹膠封片。 雄激素陽性灰度值測定 免疫組織化學：1. 載玻片用多聚賴氨酸處理以防脫片。撈片后置烤箱5860oC,3060min以使切片緊密粘附。2. 切片常規(guī)脫蠟至水。3. 3%的雙氧水室溫510分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。4. 熱抗原修復： 枸櫞酸鹽緩沖液（），電爐加熱至沸騰后斷電，間隔510分鐘后，反復12次。冷卻后PBS()洗滌1—2次。5. 滴加5%BSA封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，不洗。6. 滴加稀釋50倍的一抗（小鼠IgG），37oC 。7. 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 2037oC 20分鐘。PBS()洗2分鐘3次8. 滴加試劑SABC，2037Oc 20分鐘。PBS() 洗5分鐘4次。9. DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（AR1022）.取1ml蒸餾水，加試劑盒中A,B,C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在530分鐘之間。蒸餾水洗滌。10. 蘇木精輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。 統(tǒng)計學方法，結果用平均值177。標準誤差（Mean177。.）表示。用單因素方差分析的方法進行統(tǒng)計學分析，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗采用Dunnet39。t法，以α=。3 結果 光鏡觀察結果TPT暴露后，低劑量組大鼠體重顯著高于對照組，中劑量組的體重低于于對照組，高劑量組體重高于對照組，但差異均不顯著（P）；與對照組相比，睪丸和附睪重量均有所增加，但差異均不顯著（P）（表1）。睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)與對照組相比，低劑量和中劑量組的睪丸指數(shù)較對照組大，高劑量組較對照組減?。▓D1），附睪指數(shù)相比沒有明顯變化，統(tǒng)計學分析沒有顯著性差異（P）（圖2）。表1 TPT暴露后SD大鼠體重、睪丸重和附睪重的變化(n=5)體重（g）睪丸重（g）附睪重（g）Control177。177。177。TPT μg/kg177。177。177。TPT 5 μg/kg177。177。177。TPT 50 μg/kg177。177。177。注：上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（P＜）圖1 TPT暴露后SD大鼠睪丸指數(shù)的變化(n=5)上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（P＜）圖2 TPT暴露后SD大鼠附睪指數(shù)的變化(n=5)上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（P＜） 地塞米松磷酸鈉處理后曲精小管直徑變化TPT暴露后SD大鼠的精子畸形率隨暴露劑量的增加而增大，且高劑量組與對照組和低劑量組間差異顯著（P）（表圖4）。SD大鼠正常精子的結構完整，頭、體、尾正常（圖41），TPT暴露后SD大鼠的精子出現(xiàn)如下畸形現(xiàn)象：體部分叉（圖42）、無尾（圖43）、頸部膨大（圖44）、彎頸（圖45）、前鉤變形（圖46）、無頭（圖47）、多個相連（圖48）、頭頸折轉（圖49）、頭尾相連（圖410）、尾部彎曲（圖411）。表2 TPT暴露后SD大鼠附睪精子畸形率的變化(n=5)樣本數(shù)觀察精子數(shù)畸形率（%）Control51000177。TPT μg/kg51000177。TPT 5 μg/kg51000177。TPT 50 μg/kg51000177。注：上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（P＜）圖3 TPT暴露后SD大鼠精子畸形率的變化(n=5)上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（P＜）圖4 伊紅染色的附睪精子照片正常精子(1)和不正常的精子（2～11）：（2）體部分叉；（3）無尾；（4）頸部膨大；（5）彎頸；（6）前鉤變形；（7）無頭；（8）多個相連；（9）頭頸折轉；（10）頭尾相連；（11）尾部彎曲。 地塞米松磷酸鈉對雄激素分泌的影響光鏡下對HE染色后觀察到睪丸和附睪組織病理變化為：低劑量處理組SD大鼠睪丸曲精小管直徑高于對照組，中劑量組和高劑量組均小于對照組，且高劑量組更明顯