生物大分子相互作用(編輯修改稿)
2025-02-14 02:21 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 蛋白 蛋白相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。 大規(guī)模篩選 操作簡(jiǎn)單，直觀（可以用熒光做報(bào)告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板篩選等） 缺點(diǎn) 它并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。因?yàn)槿诤系鞍紫嗷プ饔眉せ?報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的 。 假陽性的發(fā)生較為頻繁。所謂假陽性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認(rèn)為是陽性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。 在酵母菌株中大量表達(dá)外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用，從而影響菌株生長(zhǎng)和報(bào)告基因的表達(dá)。 噬菌體展示技術(shù) 一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親和選擇相結(jié)合的技術(shù) 以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，進(jìn)而通過親和富集法表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體 . 廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)、基因克隆等多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域 噬菌體展示的基本原理 (1)在 p Ⅲ 和 p Ⅷ 衣殼蛋白的 N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)保持的外源基因天然構(gòu)象，也能被相應(yīng)的抗體或受體所識(shí)別； (2)利用固定與固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵?(panning)方法，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體； (3)外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈 DNA 測(cè)序推導(dǎo)出來 . 噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用 噬菌體隨機(jī)多肽文庫 噬菌體抗體庫 蛋白質(zhì)的定向改造 cDNA 文庫的表達(dá)篩選 應(yīng)用噬菌體展示，可合成、篩選到許多我們想要的蛋白（如融合肽、抗體、酶），這些蛋白具有預(yù)期的催化特性或結(jié)合親和力，或者具有用于胞內(nèi)、胞外診斷、人體疾病免疫治療和生物催化作用時(shí)所需的特異性。 噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 高通量的淘選 可用于模擬表位的篩選 易于純化 高通量的淘選 將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫，利用抗原 抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，如此反復(fù)數(shù)輪擴(kuò)增、淘選，即可將有用的基因從多達(dá) 百萬以上 的噬菌體克隆中分離出來。 可用于模擬表位的篩選 利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報(bào)道較多 李全喜等（ 1997）利用單抗 9E10篩選噬菌體隨機(jī)肽庫，結(jié)果獲得了兩個(gè)陽性克隆，其中一個(gè)與抗原天然序列同源，而另一個(gè)則完全不同（即為模擬表位）。模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用 乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體 。 易于純化 重組噬菌體的純化步驟簡(jiǎn)單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。目前用于鑒定表位和受體所用的噬菌體載體為 M13單鏈?zhǔn)删w。由于 M13噬菌體是溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過 離心收集培養(yǎng)上清 ，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。 用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。 免疫共沉淀（ CoImmunoprecipitation） 缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用 通過質(zhì)譜確定捕獲的蛋白 應(yīng)用 通常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合產(chǎn)生相互作用。 用于驗(yàn)證確定某種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 注意的問題 1）細(xì)胞裂解 采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì) 相互作用，多采用非離子變性劑（ NP40或 Triton X100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。 不能用高濃度的變性劑（ ％ SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的 cocktailer。 2） 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用 3）使用對(duì)照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的 IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔 IgG 優(yōu)點(diǎn) CoIP是檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法，在此方法中 ,蛋白質(zhì)及復(fù)合物均以天然狀態(tài)存在，符合體內(nèi)實(shí)際情況，能更真實(shí)的反映出蛋白質(zhì)間的相互作用情
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