精減9分子生物學技術簡介08碩(編輯修改稿)
2025-02-14 02:16 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 的反應原理 ? PCR反應時 ， 一般采用 變性 復性 延伸三步循環(huán) ， 也可采用 變性 延伸 兩步循環(huán) 。 1． 變性： 通常采用加熱變性 ， 即將模板DNA或延伸后的雙鏈 DNA加熱到 950C，使雙螺旋 DNA解開成為單鏈 。 2． 復性： 通過降低反應溫度至 550C， 使兩種引物能與兩條解開的 DNA互補鏈的 3`端粘合 ， 以提供 DNA聚合酶催化聚合所需的 3`OH。 3． 延伸： 將反應溫度提高到約 700C， 在耐熱 DNA聚合酶的催化下 ， 根據(jù)模板 DNA提供的堿基順序 ， 合成兩條互補鏈 ， 從而使模板 DNA擴增一倍 。 按照上述步驟重復操作約 30次 ， 即可將模板 DNA擴增數(shù)百萬倍 。 Cycle1 Cycle2 Cycle3 flashfilm PCR的主要用途 （ 一 ） 目的基因的克?。? ① 利用特異性引物以 cDNA或基因組DNA為模板 ， 獲得已知的目的基因； ② 利用簡并引物從 cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的 DNA片段； ③ 利用隨機引物從 cDNA文庫或基因組文庫中隨機獲得目的基因 。 （ 二 ） 基因的體外突變： ? 采用隨意設計的引物 ， 在體外對基因進行嵌合 、 缺失 、 點突變等改造 。 （ 三 ） DNA的微量分析： ? 由于 PCR技術具有高度敏感性 ， 故可用于微量 DNA的分析檢測 。 核酸純化技術與電泳技術 PCR技術 分子雜交與印跡技術 基因靶向技術 Contents （ 一 ） 分子雜交： 不同來源的單鏈核酸 （ DNA或 RNA） ， 只要它們具有 大致相同的堿基序列 ， 經(jīng)過退火處理 ，就能重新形成雜種雙螺旋 ， 這一現(xiàn)象稱為 分子雜交 （ molecular hybridization） 。 利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組 DNA分子中的同源基因或同源序列 。 三、分子雜交與印漬技術 （ 二 ） 印跡技術： 首先由 Edwen Southern在 1975年提出 。 其基本操作過程是：將 DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離 后 ， 置 NaOH液中浸泡 ， 從而將凝膠中的 DNA變性 為單鏈；然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上 ， 上面放上大量吸水紙巾 ， 利用吸水紙巾的毛細作用 ， 將單鏈 DNA從凝膠中 轉移 到硝酸纖維素膜上 ， 再將膜置 80℃ 烘干并使單鏈 DNA分子 固定 在膜上 ， 再用于分子 雜交 分析 。 用于 DNA印漬的技術又稱為 Southern Blotting或Southern 雜交 。 Southern Blotting 酶標記的探針雜交 顯色 不同內(nèi)切酶切基因組 DNA 變性、轉移至硝酸纖維素膜上 酶切后的基因組
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