【文章內(nèi)容簡介】 216。 雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時間后，采用抑菌圈測量儀測量每組試驗雙碟抑菌圈的直徑。o 結(jié)果計算及可靠性檢驗216。 以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，以濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。216。 經(jīng)計算得到回歸直線方程216。 相關(guān)系數(shù)： 1r≥o 三劑量法（ 3 ? 3法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各三個劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對微生物產(chǎn)生的效力。216。 三劑量法用于抗生素藥品的仲裁或標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定 。操作步驟－三劑量法o 基本要點216。 中劑量點的抑菌圈直徑應(yīng)在15～ 18mm。216。 三個劑量之比為 1:（ :1）。o 點樣216。 每組雙碟至少為 9個，一般為 15個。216。 在每個雙碟的 6個鋼管中，互相間隔的 3個鋼管分別滴加高、中、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余 3個鋼管內(nèi)分別滴加相應(yīng)的高、中、低濃度的供試品溶液。216。 按 SH→ TH→ SM→ TM→ SL→ TL或 TH→ SH→ TM→ SM→ TL→ SL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、中、低劑量溶液。操作步驟－三劑量法o 三劑量法雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖S3：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量 S2：標(biāo)準(zhǔn)品中劑量 S1：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量T3：供試品高劑量 T2：供試品中劑量 T1：供試品低劑量操作步驟－三劑量法o 抑菌圈的測量216。 雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時間后，采用抑菌圈測量儀測量每組試驗雙碟抑菌圈的直徑。o 結(jié)果計算及可靠性檢驗o 硫酸慶大霉素中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法實驗條件o 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基 I（ ～ ）o 試驗菌：短小芽孢桿菌 [CMCC(B)63 202]中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法實驗條件o 緩沖液： 取磷酸氫二鉀 ，加水使成 1000ml，濾過，在 115℃ 滅菌 30分鐘。 K2HPO43H2O（ +3 18） =中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法實驗條件o 雙碟的制備：將雙碟置于水平面上，加底層培養(yǎng)基 20ml，待凝固后，加菌層培養(yǎng)基5ml，凝固后備用。菌層培養(yǎng)基中菌懸液的量約為培養(yǎng)基量的 2%。加菌懸液的量可視抑菌圈大小及清晰程度進(jìn)行調(diào)節(jié)。稱樣量的計算o 按標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)識效價、供試品的標(biāo)識量或估計效價計算稱樣量：中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：o 假設(shè)：硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品的效價為 636單位 /mg，理論計算應(yīng)精密稱取 ，置 50ml量瓶（ 636單位/mg≈50000單位）中，恰好為 1000單位，但實際操作中一般稱量數(shù)接近即可，如精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 。中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟： [水 ] 50ml 制成 /ml①o 精密量取 ① 5ml buffer 50ml 制成 位 /ml②o 精密量取 ② 5ml buffer 50ml 制成 位 /mlo 精密量取 ② 5ml buffer 100ml 制成 位 /ml慶大霉素 2～ 12單位 /ml中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：p 供試品溶液的制備（原料）： 根據(jù)硫酸慶大霉素原料的估計效價計算供試品的稱樣量。216。 假設(shè)：供試品的估計效價為 590單位 /mg，則稱樣量為 50000/590=，但實際取樣量為 ， 第一步稱樣置 50ml量瓶中，實際 估 計 效價 為636u/mg/＝ 單 位 /mg。 中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟： [水 ] 50ml ①o 精密量取 ① 5ml buffer 50ml ②o 精密量取 ② 5ml buffer 50ml o 精密量取 ② 5ml buffer 100ml中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 供試品溶液的制備（制劑）o 片劑：取本品 10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（根據(jù)平均片重及標(biāo)示量折算，約相當(dāng)于慶大霉素 ） ,如為糖衣片，取 5片，全部研細(xì)，加滅菌水振搖使硫酸慶大霉素溶解，并稀釋成每 1ml中約含 1000單位的懸浮液，搖勻，靜置，取上清液適量，照硫酸慶大霉素項下測定方法測定。中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 平均片重為 o 規(guī)格為 40mg(4萬單位 )o 暫估計其標(biāo)示量為 95%o 第一步需制成 1000單位 /ml溶液，擬取供試品 10萬單位為：100000(4000095%)=，實際稱取 ，則實際估計標(biāo)示量為：中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 用鋼管放置器或適宜方法等距離均勻放置不銹鋼小管，并靜置 5～10分鐘，使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再滴加抗生素溶液。 o 每次以 5個雙碟為一 “小分隊 ”滴加藥液。o 滴加溶液：按 SH→ TH→ SL→ TL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低劑量溶液?？梢允垢叩蛣┝康囊志χ睆讲町愶@著，從而提高檢定靈敏度。o 培養(yǎng)溫度和時間：培養(yǎng)溫度為 35～ 37℃ ，培養(yǎng)時間為 14～ 16h。o 結(jié)果計算：測定抑菌圈，進(jìn)行可靠性檢驗，計算效價，可靠性檢查若能通過，且可信限率不超過 7%，則試驗數(shù)據(jù)有效。如果所測得的效價結(jié)果低于估計效價的 90%或高于 110%時，則檢驗結(jié)果只作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計效價，重新試驗。o 平均可信限率不大于 7%的品種216。 紅霉素、琥乙紅霉素、依托紅霉素216。 克拉霉素216。 硫酸西索米星216。 硫酸奈替米星216。 硫酸依替米星216。 硫酸慶大霉素216。 硫酸小諾霉素操作要點o 第一步一般應(yīng)制成 500或 1000單位 /毫升的溶液，以后逐步稀釋至供試濃度的溶液，每步稀釋的量取量以不少于 2ml為宜，稀釋步驟應(yīng)少于 3步。o 溶解：對于需用乙醇溶解的樣品，由于溶解樣品時所用乙醇量較大，加滅菌水后溶液放熱，因此需充分搖勻后加滅菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室溫后再稀釋至刻度。操作要點o 培養(yǎng)基的 pH值，對試驗結(jié)果影響很大，使用時培養(yǎng)基的 pH值應(yīng)調(diào)節(jié)到適合該品種試驗的最佳范圍。通常滅菌后的 pH值范圍為 ～ ～ 。對堿性抗生素而言，在偏堿性條件下它的抗菌活力強(qiáng)，如氨基糖苷類的鏈霉素在 pH值 力強(qiáng)，抑菌圈清晰，當(dāng)抑菌圈偏小時，可考慮把培養(yǎng)基的 pH值適當(dāng)調(diào)高至 。對酸性或兩性抗生素，在酸性條件下它的抗菌作用強(qiáng)，使用pH值 ～ 。通常滅菌后 pH值會下降 ，因此 pH值應(yīng)略高 ～ 。調(diào)節(jié)時要注意逐漸加堿，防止過量，否則再加鹽酸矯正，將會增加培養(yǎng)基的含鹽量，從而降低培養(yǎng)基的使用效果。 操作要點 o 試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應(yīng)保持菌種及菌液的新鮮。o 一般菌種一月轉(zhuǎn)種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進(jìn)行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。o 試驗菌傳代最好不超過 5次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后，應(yīng)在 65℃加熱 30分鐘，使菌體的菌齡一致，用革蘭氏染色，應(yīng)有芽孢 85%以上。操作要點o 加入菌懸液的體積，一般不少于 ，并且不大于上層培養(yǎng)基體積的 2%。如果加入菌懸液的體積過小，則在同樣實驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大，造成實驗誤差；如果加入菌懸液的體積過大，則會使上層培養(yǎng)基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養(yǎng)基中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊，影響測定結(jié)果。對于加入菌懸液體積的控制，可通過調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來實現(xiàn)。操作要點o 在制備菌層培養(yǎng)基時，將菌液加入菌層培養(yǎng)基后，立即充分搖勻，但應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。o 加入芽孢懸液時，菌層培養(yǎng)基的溫度為65℃ ，對非芽孢懸液時，菌層培養(yǎng)基的溫度一般為 48～ 50℃ 。o 放置孵箱培養(yǎng)時排放應(yīng)不得超過三層，避免因培養(yǎng)溫度不均勻而導(dǎo)致各雙碟中抑菌圈大小不一。o 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的同質(zhì)性o 抑菌圈質(zhì)量的控制o 直線斜率的控制o 直線截距的控制5. 影響因素－標(biāo)準(zhǔn)品與供試品同質(zhì)o 抗生素效價測定方法依據(jù)的原理是量反應(yīng)平行線原理，即 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品劑量的反應(yīng)直線是相互平行的 。如不平行，則斜率不等，計算結(jié)果將產(chǎn)生較大的誤差。5. 影響因素－標(biāo)準(zhǔn)品與供試品同質(zhì)o 多組分抗生素標(biāo)準(zhǔn)品所含的抗菌活性物質(zhì)或影響抗菌活性（增強(qiáng)或拮抗）物質(zhì)的量與供試品有所不同，則可使量反應(yīng)直線不平行。o 用于標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液制備的緩沖溶液 pH、鹽濃度不相同。 o 供試品中所含有的如維生素、氨基酸、無機(jī)鹽或其他生長物質(zhì)，而標(biāo)準(zhǔn)品中沒有，在營養(yǎng)條件低的培養(yǎng)基上即會產(chǎn)生影響。o 某些對光敏感的多烯類抗生素在標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液配制，及試驗過程中