【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 oamingagent） ? 概念： ? 降低泡沫的液膜強(qiáng)度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。 ? ?? 種類：表面活性劑，低表面張力。 ? 天然動(dòng)植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。 ? ?? 作用： ? 消除泡沫，防止逃液和染菌。 培養(yǎng)基種類及其質(zhì)量控制技術(shù) ? 培養(yǎng)基的種類 ? 按用途：選擇性、鑒別性、富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等 ? 按物理性質(zhì)：固體，半固體、液體培養(yǎng)基 ? 按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基 ? 按發(fā)酵過(guò)程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補(bǔ)料培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基 ? ?? 概念：（ solid medium） ? 細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。 ? ?? 制備： ? 液體培養(yǎng)基添加 %瓊脂粉。 ? ?? 作用： ? 提供菌體的生長(zhǎng)繁殖，形成孢子。 固體培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制 ? 單細(xì)胞培養(yǎng)基： ? 營(yíng)養(yǎng)豐富，滿足菌體生長(zhǎng)迅速，不能引起變異。 ? ?? 孢子培養(yǎng)基： ? 基質(zhì)濃度較低，無(wú)機(jī)鹽濃度適量，以利于孢子形成。營(yíng)養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。 種子培養(yǎng)基 ? 概念：（ seed medium） ? 供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基 ,為液體。 ? 作用： ? 使種子擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長(zhǎng)形成強(qiáng)壯、健康和高活性的種子。 種子培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制 ? 培養(yǎng)基成分必需完全，營(yíng)養(yǎng)豐富。 ? 用速效性、容易被利用的碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。 ? 種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大。 ? 縮短發(fā)酵的延滯期。 發(fā)酵培養(yǎng)基 ? 概念： (fermentation medium) ? 提供微生物生長(zhǎng)、目標(biāo)產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。 ? 作用： ? 不僅要滿足菌體的生長(zhǎng)和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。 發(fā)酵培養(yǎng)基－要求 ? 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中。 ? 組成上豐富完整。 ? 不同菌種和不同產(chǎn)物，對(duì)培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。 補(bǔ)料培養(yǎng)基 (fed medium） ? 概念：發(fā)酵過(guò)程中添加補(bǔ)充的培養(yǎng)基。 ? 作用：穩(wěn)定工藝條件，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量 ? 組成：各種必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體 ? 制備：按單一成分配制，各自獨(dú)立控制，或按一定比例制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基。 控制發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量 ? （ 1）控制水質(zhì)： ? 恒定水源和恒定的水質(zhì)。 ? 地下深層井水，對(duì)水質(zhì)定期化驗(yàn)檢查，使用符合要求的水質(zhì)配制各種培養(yǎng)基 ? 措施：檢測(cè)與控制水質(zhì)參數(shù) ? pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類和含量。 （ 2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量： 來(lái)源與種類的選擇 農(nóng)副產(chǎn)品 ： 因品種 、 產(chǎn)地 、 加工 、 貯存條件不同而質(zhì)量差異較大 。 化學(xué)原料 ： 雜質(zhì)含量也不相同 。 ?? 措施：保持穩(wěn)定的原料來(lái)源。更換原料時(shí)，必需再進(jìn)行一系列試驗(yàn)，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的控制和穩(wěn)定性。 原料的選擇試驗(yàn)： ? 不同碳源、氮源對(duì)菌種生長(zhǎng)的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。 ? 對(duì)原料進(jìn)行試驗(yàn)，選擇滿足發(fā)酵要求的來(lái)源。 ? 注意： ? 碳氮濃度與配比：適宜 ? 速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢(shì) ? pH：配制時(shí)加入酸堿性物質(zhì)搭配，甚至使用緩沖劑。 （ 3）控制培養(yǎng)基的黏度： ? 對(duì)發(fā)酵的影響： ? 高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌 ? 影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過(guò)程 ? 直接影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取造成困難 ? 措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì) （ 4）控制滅菌操作： 高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。 ? 較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間滅菌，營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。 ? 磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，降低利用度。 ? 維生素等不耐高溫分解破壞、失活。 制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制 ? 一般設(shè)計(jì)原則 ? 設(shè)計(jì)思路 ? 計(jì)算與定量配制 ? 優(yōu)化 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)一般原則 ? 生物學(xué)原則：根據(jù)不同微生物營(yíng)養(yǎng)和反應(yīng)需求設(shè)計(jì)。 ? 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當(dāng)。 ? 成分之間比例：恰當(dāng)， C/N比適宜。 ? 原料之間：不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。適宜的 pH和滲透壓 ? 工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過(guò)程容易控制。 ? 低成本原則：原料來(lái)源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。 ? 高效經(jīng)濟(jì)原則：滿足菌體生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)基本思路 起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗(yàn)和使用。 ? 單因素實(shí)驗(yàn)：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。 ? 多因素實(shí)驗(yàn)：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。 ? 中試放大試驗(yàn)：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。 ? 綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個(gè)適宜的生產(chǎn)配方。 理論計(jì)算與定量配制 微生物生長(zhǎng)和生產(chǎn)可用下列表達(dá)式表示： 碳源和能源＋氮源＋其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) → 細(xì)胞＋產(chǎn)物＋ CO2＋ H2O＋熱量 ? 單位細(xì)胞生物量所需最小的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) : ? 單位產(chǎn)量的最小底物濃度 : 碳源和氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)化率計(jì)算和分析 ? 初步計(jì)算：參考微生物的化學(xué)和元素組成。 ? 轉(zhuǎn)化率：?jiǎn)挝毁|(zhì)量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細(xì)胞量。 ? 理論轉(zhuǎn)化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算 ? 實(shí)際轉(zhuǎn)化率：發(fā)酵過(guò)程中實(shí)際測(cè)量數(shù)值計(jì)算。 ? 目標(biāo)：使實(shí)際轉(zhuǎn)化率靠近理論轉(zhuǎn)化率。 滅菌工藝 ? 滅菌方法與原理 ? 培養(yǎng)基滅菌工藝 ? 空氣除菌工藝 幾個(gè)概念 ? 雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。 ? 污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。 ? 消毒：殺滅或清除病原微生物，達(dá)到無(wú)害化程度，殺滅率 %以上。 ? 殺菌：殺滅或清除一切微生物，達(dá)到無(wú)活微生物存在的過(guò)程，殺滅率 %以上。 ? 滅菌：微生物殺滅率 %以上。 滅菌方法與原理 ? 化學(xué)滅菌 ? 物理滅菌 化學(xué)滅菌 ? 用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。 ? 化學(xué)滅菌劑： ? 氧化劑類等，鹵化物類，有機(jī)化合物等。 ? 機(jī)理：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。 ? 應(yīng)用：皮膚表面、器具、實(shí)驗(yàn)室和工廠的無(wú)菌區(qū)域的臺(tái)面、地面、墻壁及空間的滅菌。 物理滅菌 ? 各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過(guò)濾等進(jìn)行滅菌 ? 紫外線等射線：局部空間 ? 干熱滅菌：實(shí)驗(yàn)室器皿 ? 蒸汽滅菌：培養(yǎng)基 ? 效果好，操作方便，廣泛使用。 3 干熱滅菌 ? 在高溫 120℃ 以上，蛋白質(zhì)、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細(xì)胞破裂，內(nèi)容物釋放，生物體死亡。對(duì)于干熱滅菌，足夠長(zhǎng)的時(shí)間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干熱滅菌效果沒(méi)有濕熱滅菌好，是實(shí)驗(yàn)室常用的器皿的方法。工業(yè)采用 160℃ 、 2h，或 170℃ 、 1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時(shí)間相應(yīng)縮短。 4 蒸汽滅菌 ? 濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，原因在于濕熱狀態(tài)下，穿透力強(qiáng)，蒸汽冷凝時(shí)釋放出大量能量，使蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)部的化學(xué)鍵破壞、降解，導(dǎo)致生物體死亡。一般在 115℃ ～ 140℃ ，保持一段時(shí)間，可以殺死各種生物體。由于蒸汽價(jià)格低廉，來(lái)源方便，效果可靠，操作控制簡(jiǎn)便，因此濕熱滅菌常用于培養(yǎng)基和設(shè)備容器的滅菌。常用條件為 115℃ ～ 121℃ ，壓力1 105Pa，維持 15～ 30分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強(qiáng)，不易殺滅。因此在設(shè)計(jì)滅菌操作時(shí)，經(jīng)常以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。為了確保徹底滅菌，實(shí)際操作中往往增加 50％的保險(xiǎn)系數(shù)。 培養(yǎng)基滅菌 ? 微生物高溫死亡動(dòng)力學(xué)與滅菌的關(guān)系 ? 微生物受熱死亡過(guò)程的一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)： ? － dX/dt= kdX ? 微生物濃度與滅菌時(shí)間成正比，濃度越高，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)。 ? 以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。 ? 確保徹底滅菌，實(shí)際操作中增加 50％的保險(xiǎn)系數(shù)。 培養(yǎng)基滅菌的操作方式 ? (1)分批滅菌操作，間歇滅菌 ,實(shí)罐滅菌： ? 配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。 ? 特點(diǎn)：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，手動(dòng)。 ? 缺點(diǎn)：加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。 分批操作的滅菌過(guò)程 分批滅菌的操作過(guò)程 ? 通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。 ? 加熱升溫： 70℃ ，取樣管、放料管通入蒸汽。 ? 維持保溫： 120℃ ，罐壓 ，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)汽和排氣量，維持 30min。 ? 冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無(wú)菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。 （ 2）連續(xù)滅菌操作 ? 高溫短時(shí)滅菌操作，連續(xù)： ? 培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過(guò)一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過(guò)程。 ? 加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。 （ 2）連續(xù)滅菌操作－流程圖 培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達(dá)到滅菌溫度（ 130－ 140℃ ） （ 2）連續(xù)滅菌－操作過(guò)程 ? 配料 ： 配料罐 ， 配制培養(yǎng)基 。 ?? ? 預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。 70－ 90℃ 。 ?? ? 加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到 130－140℃ 。 ?? ? 維持罐：維持滅菌時(shí)間 ,5－ 7分鐘 。 ?? ? 冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)冷卻水管冷卻。 40－50℃ 。 ? 輸入滅菌的發(fā)酵罐中。 連續(xù)滅菌的特點(diǎn) 1）高溫快速滅菌工藝，營(yíng)養(yǎng)成分破壞的少 2）熱能利用合理，易于自動(dòng)化控制； 3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌； 4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。 5）對(duì)壓力要求高，一般為 MPa。 空氣除菌操作工藝 ? 發(fā)酵對(duì)空氣的要求 ? 好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。 ? 連續(xù)一定流量的壓縮無(wú)菌空氣。 ? 壓強(qiáng)： MPa。 ? 空氣質(zhì)量：相對(duì)濕度小于 70％；比培養(yǎng)溫度高 10－ 30℃ ；潔凈度 100級(jí)。 工業(yè)制備大量空氣的方法 ? 加熱滅菌： 空氣在進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需用空壓機(jī)以提高壓力，所以空氣熱滅菌時(shí)所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時(shí)的溫度升高來(lái)實(shí)現(xiàn) . ? 靜電除菌： 靜電除塵是利用靜電引力來(lái)吸附帶電離子而達(dá)到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數(shù)帶有不同的電荷，沒(méi)有電荷的微粒進(jìn)入高壓靜電場(chǎng)時(shí)則會(huì)被電離成帶電微粒，但對(duì)于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當(dāng)產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對(duì)微粒的拖帶力或微粒布朗運(yùn)動(dòng)的動(dòng)量時(shí)，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對(duì)很小的微粒效率較低。 ? 介質(zhì)過(guò)濾： 是使空氣通過(guò)經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過(guò)濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。 空氣除菌原理 空氣中附著在塵埃上的微生物大小為 。 是依靠氣流通過(guò)濾層時(shí)，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動(dòng)過(guò)程中出現(xiàn)無(wú)數(shù)次改變氣速大小和方向的繞流運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致微生物微粒與濾層纖維間產(chǎn)生撞擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)了過(guò)濾。 （ 1） .慣性沖擊滯留 作用機(jī)理 ? 當(dāng)微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運(yùn)動(dòng)時(shí)，空氣受阻即改變運(yùn)動(dòng)方向，繞過(guò)纖維前進(jìn)，而微粒由于它的運(yùn)動(dòng)慣性較大，未能及時(shí)改變運(yùn)動(dòng)方向隨主導(dǎo)氣流前進(jìn)，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附，微粒就滯留在纖維表面上。 （２）、攔截滯留作用機(jī)理 當(dāng)氣流速度下降到一定值時(shí)，若微粒 隨氣流慢慢靠近纖維時(shí)，受纖維所阻改變 方向，繞過(guò)纖維前進(jìn)，并在纖維的周邊形 成一層邊界滯留區(qū)，滯留區(qū)的氣流流速更 慢，當(dāng)與纖維表面接觸時(shí)就被捕集。 （３）、布朗擴(kuò)散作用機(jī)理 直徑很小的微粒在很慢的氣流中能產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線運(yùn)動(dòng)，稱為布朗擴(kuò)散。 （４）、重力沉降作用機(jī)理 ?重力沉降是一個(gè)穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對(duì)它的拖帶力時(shí)，微粒就容易沉降。 （５）、靜電吸附作用機(jī)理 懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電荷，這些帶電的微粒會(huì)受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。 當(dāng)空氣流過(guò)介質(zhì)時(shí)，上述五種除菌機(jī)理同時(shí)起作用，不過(guò)氣流速度不同，起主