【文章內容簡介】 oamingagent） ? 概念： ? 降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。 ? ?? 種類：表面活性劑，低表面張力。 ? 天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。 ? ?? 作用： ? 消除泡沫，防止逃液和染菌。 培養(yǎng)基種類及其質量控制技術 ? 培養(yǎng)基的種類 ? 按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等 ? 按物理性質：固體，半固體、液體培養(yǎng)基 ? 按化學組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基 ? 按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補料培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基 ? ?? 概念：（ solid medium） ? 細菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。 ? ?? 制備： ? 液體培養(yǎng)基添加 %瓊脂粉。 ? ?? 作用： ? 提供菌體的生長繁殖，形成孢子。 固體培養(yǎng)基－要求與質量控制 ? 單細胞培養(yǎng)基： ? 營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。 ? ?? 孢子培養(yǎng)基： ? 基質濃度較低，無機鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。 種子培養(yǎng)基 ? 概念：（ seed medium） ? 供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基 ,為液體。 ? 作用： ? 使種子擴大培養(yǎng)，增加細胞數(shù)目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。 種子培養(yǎng)基－要求與質量控制 ? 培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。 ? 用速效性、容易被利用的碳、氮源和無機鹽等物質，但濃度不宜高。 ? 種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應，主要成分接近，不能差異太大。 ? 縮短發(fā)酵的延滯期。 發(fā)酵培養(yǎng)基 ? 概念： (fermentation medium) ? 提供微生物生長、目標產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。 ? 作用： ? 不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關鍵和最重要的培養(yǎng)基。 發(fā)酵培養(yǎng)基－要求 ? 營養(yǎng)物質濃度和粘度適中。 ? 組成上豐富完整。 ? 不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。 補料培養(yǎng)基 (fed medium） ? 概念：發(fā)酵過程中添加補充的培養(yǎng)基。 ? 作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量 ? 組成：各種必要的營養(yǎng)物質，碳源、氮源、前體 ? 制備：按單一成分配制，各自獨立控制，或按一定比例制成復合補料培養(yǎng)基。 控制發(fā)酵培養(yǎng)基質量 ? （ 1）控制水質： ? 恒定水源和恒定的水質。 ? 地下深層井水，對水質定期化驗檢查，使用符合要求的水質配制各種培養(yǎng)基 ? 措施：檢測與控制水質參數(shù) ? pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類和含量。 （ 2）控制培養(yǎng)基原料的質量： 來源與種類的選擇 農(nóng)副產(chǎn)品 ： 因品種 、 產(chǎn)地 、 加工 、 貯存條件不同而質量差異較大 。 化學原料 ： 雜質含量也不相同 。 ?? 措施：保持穩(wěn)定的原料來源。更換原料時，必需再進行一系列試驗，確保產(chǎn)量和質量的控制和穩(wěn)定性。 原料的選擇試驗： ? 不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。 ? 對原料進行試驗，選擇滿足發(fā)酵要求的來源。 ? 注意： ? 碳氮濃度與配比：適宜 ? 速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢 ? pH：配制時加入酸堿性物質搭配，甚至使用緩沖劑。 （ 3）控制培養(yǎng)基的黏度： ? 對發(fā)酵的影響： ? 高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌 ? 影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過程 ? 直接影響菌體對營養(yǎng)的利用 ? 目標產(chǎn)物的分離提取造成困難 ? 措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質 （ 4）控制滅菌操作： 高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。 ? 較高溫度下長時間滅菌，營養(yǎng)成分會破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質。 ? 磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應，生成沉淀或絡合物，降低利用度。 ? 維生素等不耐高溫分解破壞、失活。 制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制 ? 一般設計原則 ? 設計思路 ? 計算與定量配制 ? 優(yōu)化 培養(yǎng)基設計一般原則 ? 生物學原則：根據(jù)不同微生物營養(yǎng)和反應需求設計。 ? 營養(yǎng)物質組成：較豐富，濃度適當。 ? 成分之間比例：恰當， C/N比適宜。 ? 原料之間：不能產(chǎn)生化學反應。適宜的 pH和滲透壓 ? 工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。 ? 低成本原則：原料來源方便，質量穩(wěn)定，質優(yōu)價廉。 ? 高效經(jīng)濟原則：滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。 培養(yǎng)基設計基本思路 起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗和使用。 ? 單因素實驗：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。 ? 多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。 ? 中試放大試驗：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。 ? 綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。 理論計算與定量配制 微生物生長和生產(chǎn)可用下列表達式表示： 碳源和能源＋氮源＋其他營養(yǎng)物質 → 細胞＋產(chǎn)物＋ CO2＋ H2O＋熱量 ? 單位細胞生物量所需最小的營養(yǎng)物質 : ? 單位產(chǎn)量的最小底物濃度 : 碳源和氮源進行轉化率計算和分析 ? 初步計算：參考微生物的化學和元素組成。 ? 轉化率：單位質量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細胞量。 ? 理論轉化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算 ? 實際轉化率：發(fā)酵過程中實際測量數(shù)值計算。 ? 目標：使實際轉化率靠近理論轉化率。 滅菌工藝 ? 滅菌方法與原理 ? 培養(yǎng)基滅菌工藝 ? 空氣除菌工藝 幾個概念 ? 雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。 ? 污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。 ? 消毒：殺滅或清除病原微生物，達到無害化程度，殺滅率 %以上。 ? 殺菌：殺滅或清除一切微生物，達到無活微生物存在的過程，殺滅率 %以上。 ? 滅菌：微生物殺滅率 %以上。 滅菌方法與原理 ? 化學滅菌 ? 物理滅菌 化學滅菌 ? 用化學物質殺滅微生物的滅菌操作。 ? 化學滅菌劑： ? 氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。 ? 機理：蛋白質變性，酶失活，破壞細胞膜透性，細胞死亡。 ? 應用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。 物理滅菌 ? 各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌 ? 紫外線等射線：局部空間 ? 干熱滅菌：實驗室器皿 ? 蒸汽滅菌：培養(yǎng)基 ? 效果好，操作方便，廣泛使用。 3 干熱滅菌 ? 在高溫 120℃ 以上，蛋白質、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細胞破裂，內容物釋放，生物體死亡。對于干熱滅菌，足夠長的時間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干熱滅菌效果沒有濕熱滅菌好，是實驗室常用的器皿的方法。工業(yè)采用 160℃ 、 2h，或 170℃ 、 1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時間相應縮短。 4 蒸汽滅菌 ? 濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，原因在于濕熱狀態(tài)下，穿透力強，蒸汽冷凝時釋放出大量能量，使蛋白質、核酸等內部的化學鍵破壞、降解，導致生物體死亡。一般在 115℃ ～ 140℃ ，保持一段時間，可以殺死各種生物體。由于蒸汽價格低廉，來源方便，效果可靠，操作控制簡便，因此濕熱滅菌常用于培養(yǎng)基和設備容器的滅菌。常用條件為 115℃ ～ 121℃ ，壓力1 105Pa，維持 15～ 30分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強，不易殺滅。因此在設計滅菌操作時，經(jīng)常以殺死芽孢的溫度和時間為指標。為了確保徹底滅菌，實際操作中往往增加 50％的保險系數(shù)。 培養(yǎng)基滅菌 ? 微生物高溫死亡動力學與滅菌的關系 ? 微生物受熱死亡過程的一級動力學反應： ? － dX/dt= kdX ? 微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。 ? 以殺死芽孢的溫度和時間為指標。 ? 確保徹底滅菌，實際操作中增加 50％的保險系數(shù)。 培養(yǎng)基滅菌的操作方式 ? (1)分批滅菌操作，間歇滅菌 ,實罐滅菌： ? 配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。 ? 特點：不需其他的附屬設備，操作簡便，手動。 ? 缺點：加熱和冷卻時間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。 分批操作的滅菌過程 分批滅菌的操作過程 ? 通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。 ? 加熱升溫： 70℃ ，取樣管、放料管通入蒸汽。 ? 維持保溫： 120℃ ，罐壓 ，排氣。調節(jié)進汽和排氣量，維持 30min。 ? 冷卻降溫：依次關閉排氣、進汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。 （ 2）連續(xù)滅菌操作 ? 高溫短時滅菌操作，連續(xù)： ? 培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內的工藝過程。 ? 加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設備執(zhí)行：加熱器，保溫設備，冷卻器。 （ 2）連續(xù)滅菌操作－流程圖 培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達到滅菌溫度（ 130－ 140℃ ） （ 2）連續(xù)滅菌－操作過程 ? 配料 ： 配料罐 ， 配制培養(yǎng)基 。 ?? ? 預熱罐：定容和預加熱。 70－ 90℃ 。 ?? ? 加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到 130－140℃ 。 ?? ? 維持罐：維持滅菌時間 ,5－ 7分鐘 。 ?? ? 冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。 40－50℃ 。 ? 輸入滅菌的發(fā)酵罐中。 連續(xù)滅菌的特點 1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少 2）熱能利用合理，易于自動化控制； 3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌； 4）增加了連續(xù)滅菌設備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。 5）對壓力要求高，一般為 MPa。 空氣除菌操作工藝 ? 發(fā)酵對空氣的要求 ? 好氧微生物需要氧氣供應，通入空氣。 ? 連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣。 ? 壓強： MPa。 ? 空氣質量：相對濕度小于 70％；比培養(yǎng)溫度高 10－ 30℃ ；潔凈度 100級。 工業(yè)制備大量空氣的方法 ? 加熱滅菌： 空氣在進入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需用空壓機以提高壓力，所以空氣熱滅菌時所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時的溫度升高來實現(xiàn) . ? 靜電除菌： 靜電除塵是利用靜電引力來吸附帶電離子而達到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數(shù)帶有不同的電荷，沒有電荷的微粒進入高壓靜電場時則會被電離成帶電微粒，但對于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對微粒的拖帶力或微粒布朗運動的動量時，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對很小的微粒效率較低。 ? 介質過濾： 是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質層中，而達到除菌的目的。 空氣除菌原理 空氣中附著在塵埃上的微生物大小為 。 是依靠氣流通過濾層時，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動過程中出現(xiàn)無數(shù)次改變氣速大小和方向的繞流運動，從而導致微生物微粒與濾層纖維間產(chǎn)生撞擊、攔截、布朗擴散、重力及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實現(xiàn)了過濾。 （ 1） .慣性沖擊滯留 作用機理 ? 當微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運動時，空氣受阻即改變運動方向，繞過纖維前進，而微粒由于它的運動慣性較大，未能及時改變運動方向隨主導氣流前進，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附，微粒就滯留在纖維表面上。 （２）、攔截滯留作用機理 當氣流速度下降到一定值時，若微粒 隨氣流慢慢靠近纖維時，受纖維所阻改變 方向，繞過纖維前進，并在纖維的周邊形 成一層邊界滯留區(qū)，滯留區(qū)的氣流流速更 慢，當與纖維表面接觸時就被捕集。 （３）、布朗擴散作用機理 直徑很小的微粒在很慢的氣流中能產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線運動，稱為布朗擴散。 （４）、重力沉降作用機理 ?重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。 （５）、靜電吸附作用機理 懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電荷，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。 當空氣流過介質時，上述五種除菌機理同時起作用，不過氣流速度不同，起主