【文章內容簡介】 復制的有關背景知識 引發(fā)體 /解旋酶 岡崎片段 SSBP 后隨鏈的模板 前導鏈的模板 DNA旋轉酶 核心酶 滑動鉗 RNA引物 DNA聚合酶的引物 (primer) ? DNA復制為什么需要引物？ ? DNA聚合酶只能催化 dNTP到已有核酸鏈的游離 3’OH上，而不能從游離核苷酸起始 DNA鏈的合成。 ? DNA聚合酶需要引物來提供 3’OH末端，然后在其上加入核苷酸來延伸 DNA鏈。 ? 細胞通常先在模板上合成一段 RNA序列，然后通過 DNA聚合酶延伸 RNA鏈的 3’OH。 ? 為什么需要一段 RNA序列作為引物來進行 DNA復制呢 ? 這可能盡量減少 DNA復制起始處的突變有關。 DNA連接酶（ DNA Ligase ） ?基本性質：能將兩段 DNA拼接起來的酶，催化 DNA相鄰的 5 ’磷酸基團和 3’羥基末斷之間形成磷酸二酯鍵，封閉 DNA單鏈缺口。 解旋酶 (helicase) 功能特點： ? 解旋酶可以促使 DNA在復制叉處打開雙鏈，解開氫鍵，形成單鏈。 ? 利用 ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵 2022/2/11 45 ★ 關于體內 DNA復制 聚合酶 III核心酶 聚合酶 I 聚合酶 III核心酶 滯后鏈 前導鏈 解旋酶 引物合成酶 RNA引物 引發(fā)體 拓撲異構酶 II ?夾子 ?聚體 ?夾子 ? 復合物 RNA引物 單鏈結合蛋白（ SSB） 大腸桿菌 DNA復制體結構示意圖 2022/2/11 46 ★ 關于體內 DNA復制 真核生物 DNA復制體結構示意圖 DNA復制與染色體復制 2022/2/11 48 1 緩沖液 10mmol/L TrisHCl， 50mmol/L KCl， pH=(室溫時約為 )，還可有添加劑、共溶劑等。 Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。 Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應特異性。 ★ 有關 PCR反應體系常識 脫氧三磷酸核苷 (dNTPs) dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP四種的等量混合物。 引物 使用濃度為 ?mol/L。濃度過低則產(chǎn)量低，過高則易導致錯配。 問題 3： PCR技術之 ABC 2022/2/11 49 模板 單、雙鏈 DNA均可。一個 PCR反應中 104至 107個模板分子可獲得較理想的效果，但由于 PCR較靈敏，更少的模板分子數(shù)在循環(huán)數(shù)增加時也會得到大量擴增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、 DNA結合蛋白類， 模板純度 不高往往是限制PCR擴增的重要因素。 耐熱性的 DNA聚合酶 有多種，均從耐熱性的細菌中分離出來，均耐高溫，普遍具有 5’→ 3’聚合酶和 5’→ 3’外切酶活性。 常用的有： 1） Taq DNA聚合酶 2） Tth DNA聚合酶 3） Vent DNA聚合酶 4）Pwo DNA聚合酶 5） Pfu DNA聚合酶 6）混合 DNA聚合酶 。 2022/2/11 50 ? 引物長度一般以 18～ 30bp為宜 ， 過短降低特異性 ，過長會引起退火時結合的模板數(shù)減少 ， 降低反應效率 。 ? 解鏈溫度 (Tm值 )很重要 ， 直接決定了擴增中可使用的退火溫度 (Ta值 )的高低 ， 兩條引物間的 Tm值越接近越好 。 ? 避免引物內部出現(xiàn)二級結構 ， 避免序列內有較長的回文結構 。 引物 3’ 端為關鍵堿基 ， 是 PCR延伸的起始端 ， 不能進行任何修飾 ， 也不能形成二級結構的可能 。 ★ PCR引物的設計一般原則 2022/2/11 51 ? 要避免兩個引物間堿基序列互補以及同一引物自身堿基序列互補 。 ? 引物 5’末端堿基可添加與模板無關的序列 (如限制性核酸內切酶的識別序列 、 ATG起始密碼子或啟動子序列等 )， 便于克隆和表達 。 ? 引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列均應無明顯同源性，以免造成不必要的非特異性擴增。 ★ PCR引物的設計一般原則 ★ PCR應用舉例 在 PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點 ? 在 PCR引物的 5’加上根據(jù)需要而設計的酶切位點，PCR產(chǎn)物內部無該切點。 ? 在酶切位點的 5’加 3個左右的 保護堿基 ，其數(shù)目多少取決該酶的性質。 ? PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后， 直接用限制酶進行切割 ，純化后與目標載體連接重組。 ? 該法適用于直接將 PCR產(chǎn)物 克隆到表達載體進行功能研究 ，但構建好的表達載體 必須測序 才能證明PCR產(chǎn)物的身份正確且沒有突變。 反向 PCR (reverse PCR) 是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的 DNA片段對某個已知 DNA片段兩側的未知序列進行擴增。 可對未知序列擴增后進行分析 ,如探索鄰接已知 DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長 cDNA的克隆 ,擴增基因文庫的插入 DNA；建立基因組步移文庫 。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 ?能從成千上萬種蛋白質混合物中純化出一種蛋白質的原因是不同蛋白質在許多理化性質上有著極大的不同。 ?這些理化性質的不同是由于氨基酸的數(shù)目和序列不同造成的。 問題 4：蛋白分離的方法 與蛋白質分離相關的理化特性 ?分子大小 ?大小 –蛋白質的分子大小主要取決于蛋白質肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。 ?常用方法 –透析 –超濾 –凝膠過濾 –離心 ?溶解特性 ?分子形狀 ?帶電特性 形狀 –形狀的不同會導致蛋白質在離心通過溶液時，或通過膜、凝膠過濾填料顆粒或電泳凝膠中的小孔運動時，都會受到它的形狀的影響。 ?方法 –梯度離心的影響 –電泳的影響 原理蛋白質的凈電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負電荷總和。若天冬氨酸和谷氨酸占優(yōu)勢，在 pH ，稱為酸性蛋白質。若賴氨酸和精氨酸占優(yōu)勢，在 pH ，稱為堿性蛋白質。 ?方法 –電泳 –離子交換層析 ?原理 –由于蛋白質分子表面親水性和疏水性帶電基團不同，因此在溶劑中的溶解度不同。 ?方法： –通過改變 pH、離子強度或加入有機試劑，促進蛋白質分子的凝聚進而形成沉淀。 ?沉淀法 –鹽析法 –有機溶劑沉淀法 問題 5：真核 mRNA的加工和成熟 ? 5’加帽 ? 3’加尾 ? 特殊堿基的修飾 ? 內含子的切除 5’端加帽 5’端帽子結構的功能： a. 翻譯起始 的必要結構，為 IFⅢ （起始因子）和核糖體對 mRNA的識別提供信號， b. 增加 mRNA的穩(wěn)定性 ，保護 mRNA 免遭 5’外切核酸酶的攻擊。 c. 運輸 ，有助于 mRNA越過核膜，進入胞質； 3’端加尾 a 大多數(shù)的真核 mRNA 都有 3’端的多聚尾巴（ polyA)，約為 200bp。 最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的 RNA轉錄后也有 3’添加 poly(A) 的現(xiàn)象。 b poly(A) 的生成 RNA末端腺苷酸轉移酶 （ poly(A) 聚合酶， PAP ） 催化前體－－ ATP polyA加尾信號 : AATAAA序列。 轉錄起始 延伸 5 ’帽子 A A U A A A