【文章內容簡介】 外加能源。 （二）水平衡計算 配料用水量：日投淀粉 ，加水比 1: = 液化液冷卻用水（使用二次水） 液化液滅酶后，溫度達 115℃，用糖化液降至 85℃（糖化液滅酶），然后用水降溫，有85℃降至 60℃。冷卻水進水溫度為 20℃，出水溫度為 58℃，需冷卻水量： W=（ +） （ 8560）247。（（ 5820） ） = 糖化工序熱量衡算 日產 300g/L 糖液 ，即 247。 = 30h，其中糖化時 間為 25h，糖化罐 100m3， 裝填系數為 75%，需糖化罐： 247。（ 100 75%）（ 30247。 24） =，取 7臺 使用板式換熱器，使糖化液（經滅酶后）由 85℃降至 60℃。使用二次水，冷卻水進水溫度為 20℃，出水溫度為 50℃，平均用水量： （ +） （ 8560）247。（（ 5020） ） =要求 2h 把 75 m3糖液冷卻至 60℃，高峰用水量： 16 247。（ +） 75000 247。 2=每日糖化罐同時運轉： 25247。 30= 罐 每日冷卻水用量： 2 = 17 第五章 發(fā)酵車間 工藝流程： 葡萄糖液 配料罐 定容罐 定容罐 配料罐 液氨 二級種子罐 蒸汽混合器 實消 維持罐 降溫 換熱器 斜面 一級種子 培養(yǎng) 發(fā)酵罐 2. 工藝簡述 1）糖化車間制備的糖化液和其他營養(yǎng)成分 ：工業(yè)淀粉、 生物素等按要求配制成培養(yǎng)基，定容。經連消系統(tǒng)滅菌，降溫至接種溫度后進行接種。 2）接種：菌種先經過一級種子擴大培養(yǎng)，再經過二級種子擴大培養(yǎng)后菌種量達到要求后再進入發(fā)酵罐進行接種，發(fā)酵。 3） 發(fā)酵時間為 32h，輔助時間為 8h，發(fā)酵過程中通過流加液氨控制 pH，通過冷卻系統(tǒng)（冷卻 塔和冷機）控制溫度，流加糖液控制殘?zhí)橇?，通過無菌空氣控制通氣量 。 4）發(fā)酵結束后，經泵進入發(fā)酵液貯罐，供提取車間用。殘?zhí)橇靠刂圃?－ 。 3. 空氣制備：空氣進入壓縮機壓縮，溫度升高，壓縮機的潤滑油進入壓縮空氣中形成油霧，需進行冷卻，大部分的水，油結成顆粒較大，濃度較高的霧粒，冷卻后又會析出大量的冷卻水，先用棉花過濾除油霧和冷凝水， 再 用膜過濾器進行除菌，提高空氣的無菌程度，制備的壓縮空氣供發(fā)酵和培養(yǎng)種子，分別進 入發(fā)酵罐和種子罐。 一般采用以下流程制備無菌空氣： 1234567891 0 采用黃色短桿菌 T613菌株，由于該菌株較其他菌株的性能粗放，并能在較高的溫度下正常發(fā)酵，全國各廠普遍用于生產，是目前生產上使用較廣的一種優(yōu)良菌株。 1）形態(tài)： 消泡劑 高濃度糖液 液氨 消泡劑 水 無機鹽 糖蜜 玉米漿 純維生素 消泡劑 水 無機鹽 糖蜜 玉米漿 純維生素 18 T613 菌株細胞典型的短，兩端鈍圓，大小為（ ~） x（ ~）微米，屬革蘭氏陽性菌，不形成芽孢而且不運動。 ： ㈠ 普通肉汁瓊脂斜面：劃線培養(yǎng) 24小時，呈中度生長，菌苔 線狀隆起，沒黃色，隨培養(yǎng)時間而顏色加深，表面濕潤光滑，有光澤，不透明，不產生色素擴散。 ㈡ 肉汁瓊脂斜面：菌落圓形，黃色，表面光滑，邊緣整齊。 ： ⑴溫度： 26～ 37℃生長良好，發(fā)酵時能耐較高溫度，發(fā)酵前期溫度達 32～ 34℃，發(fā)酵后期達 36～ 40℃，產酸理想。 ⑵ PH： PH 6～ 8，生長良好， PH 5較弱， PH 4或 PH 11均可能生長。 ⑶對氧要求：好氧或兼性厭氧。 ⑷其他特征：脲酶活力強，需生物素作為生長因子但不需促進因子，對于氯化銨，硫酸銨，磷酸銨，尿素均能利用 ，在 5%NaCL的肉汁培養(yǎng)基中生長良好。在含 2%尿素的普通肉汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，淀粉可水解。過氧化氫酶屬于陽性，可產生硫化氫和吲哚， VP 試驗呈陽性反應。脲酶反應呈強陽性，液氨濃度 %：能強烈利用醋酸產 L谷氨酸，產率在 5%以上，對醋酸轉化率為 50%以上。 c. 菌種選擇、分純，保存 （ 1）選菌： 通過誘變劑進行育種，篩選優(yōu)良菌種。 （ 2）分離純化： 分兩步操作：第一步進行平板劃線分離：第 2步挑選菌落，移接于試管斜面培養(yǎng)基上，分別用三角瓶進行搖瓶發(fā)酵試驗（初篩，復篩），比較產酸，選擇產酸高的菌株供生產 使用。 （ 3）保藏： 菌種移接于斜面后，于 31℃ 下培養(yǎng) 20~24h，待長滿黑褐色孢子后，放在 2~4℃冰箱中保藏，此法可保藏 1~2 個月。如果要長期保藏則必須定期進行移種或采用沙土罐等載體吸附法進行菌種長期保藏。 擴培流程：斜面菌種 一級種子搖床培養(yǎng) 二級種子培養(yǎng) 發(fā)酵大罐 菌種室 發(fā)酵車間 1） 斜面菌種的培養(yǎng)： 斜面培養(yǎng)基必須有利于菌種生長 ,以多含有機氮而不含或少含糖為原則 。 斜面菌 種要求絕對純 ,不得混有任何雜菌和噬菌種 ,培養(yǎng)條件應有利于菌種繁殖 。 (1)斜面培養(yǎng)基組成 葡萄糖 % 蛋白胨 % 牛肉膏 % 氯化鈉 % 瓊脂 ~% ~（傳代和保藏斜面不加葡萄糖） (2)培養(yǎng)條件 谷氨酸斜面菌種一般在 30~32℃ 培養(yǎng) 18～ ，要仔細觀察菌苔生長情況、菌苔顏色和邊緣等特征，確認正常后存入冰箱備用。 2） 一級種子培養(yǎng) ： 一級種子接著的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應以少含糖分、多含 有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于菌體生長考慮。 (1)培養(yǎng)基組成 葡萄糖 % 尿素 % 硫酸鎂 % 磷酸氫二鉀 % 玉米漿 ~%（按質增減） 硫酸亞鐵，硫酸錳各 2ppm （培養(yǎng)基成分可因菌種不同酌情增減） (2)培養(yǎng)條件 200mL培養(yǎng)基 19 左右、頻率 100次 /min左右的往復式搖床上振蕩 32~330C振蕩培養(yǎng) 9~10h。 (3)一級種子質量要求 種齡 9~10h； pH凈增 OD650值 ；殘?zhí)亲笥遥粺o噬菌體污染；鏡檢要求菌體生長均勻、粗壯，排列整齊，革蘭氏陽性反應。 (4)通常將每批培養(yǎng)好的一級種子液取樣倒雙層平板進行染菌檢查，以便生產跟蹤分析，為下批一級種子培養(yǎng)的預防染菌工作提供參考。 3）二級種子培養(yǎng) (1)培養(yǎng)基組成 玉米漿 ~% 水解糖 % 磷酸氫二鉀 % 尿素 % 硫酸鎂 % 二價鐵離子 2mg/l (2)培養(yǎng)條件 接種量： % 培養(yǎng)溫度： 31~330C 攪拌轉速：攪拌轉速 150r/min，通風量為 ~（ m3/min） 培養(yǎng)時間：培養(yǎng)時間長短根據生產中采用的培養(yǎng)工藝與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及濃度而定。采用流加液氨作為氮源的工藝，只要生物素的濃度和殘留的葡萄 糖 濃度足夠，可適當延長培養(yǎng)時間，以爭取更大菌體濃度，有利于提高二級種子量，目前生產上通常在 10~14小時。 培養(yǎng) pH ：一般控制 pH ~，初始 pH 左右，在培養(yǎng)過程中通過流加液氨來維持 pH ~，同時供給菌體生長所需的氮源，通常在培養(yǎng)基殘?zhí)墙档椭?～ %時結束培養(yǎng)。 (3)二級種子的質量要求 種齡 ：視培養(yǎng)工藝而定，一般在 10h以上； OD值：視培養(yǎng)工藝而定 以上，一般凈增 pH ： ； 殘?zhí)牵?% ； 噬菌體檢查：無； 鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊，革蘭氏陽性反應。 1） 培養(yǎng)基： （ 1） 碳源：采用淀粉水解糖液作為碳源，根據發(fā)酵初糖要求配制成為適當葡萄糖含量的培養(yǎng)基。由于滅菌過程中蒸汽冷凝水和接種后成熟種子液的加入，會使培養(yǎng)基的各成分濃度降低，所以，在培養(yǎng)基配制時，應充分使培養(yǎng)基在定容后的葡萄糖含量適當并能滿足發(fā)酵初糖濃度的要求。根據流加糖液 是高濃度的糖液，為了避免淀粉水濃縮出來的糖液不再特意滅菌，對發(fā)酵無影響，且可明顯減少葡萄糖液的加熱損失。 （ 2） 氮源：氮源是合成菌體蛋白質、核酸等含氮物質和合成谷氨酸氨基的來源。谷氨酸的碳氮比為 100：（ 13~30）， 當碳氮比在 100： 11 以上才開始累積谷氨酸。碳氮比對谷氨酸發(fā)酵的影響很大，一般情況下，發(fā)酵工序生產 1t 谷氨酸耗用液氨量是 260~300kg. 玉米漿 、生物素和液氨是本設計的主要氮源 . （ 3） 無機鹽 ： ① 磷酸鹽：磷是某些蛋白質和核酸的組成成分，參與一系列的代謝反應， ADP、 ATP 是重要的能量傳遞 者。微生物對于磷的需要量一般為 ~② 硫酸鎂：鎂是某些細菌和葉綠素的組成成分，它的離子狀態(tài)是許多重要的酶的激活劑。 20 如果鎂離子含量太少，就會影響基質的氧化。一般革蘭氏陽性菌對 Mg2+的最低要求量是25mg/L。 ③ 鉀鹽 ： 它是許多酶的激活劑。菌體生長需 K+約為 ~，谷氨酸生成需 K+約~。 ④ 微量元素 ： 錳是某些酶的激活劑， 羧化反應必需酶。 （ 4） 生長因子 ： 凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、 維生素等均稱為生長因子。 本設計采用純生物素、玉米漿、糖蜜三者作為谷氨酸發(fā)酵用生物素，具體比列要視情況而調整。 為了保證連續(xù)滅菌時每批發(fā)酵液定容體積準確，將配料水與培養(yǎng)基料液分別單獨進行滅菌再混合。 滅菌采用生熟料用交換器互換流程， 可以大大降低蒸汽和冷卻水用量。具體料液循環(huán)見下： 定 容 罐維 持 罐1 ＃ 交換 器2 ＃ 交換 器蒸 汽冷 卻 水 箱冷 卻 水 塔去 發(fā) 酵 罐 發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制： 1）溫度控制：在谷氨酸發(fā)酵前期是 長菌期階段 ， 應滿足菌體生長所需的最適溫度。若長菌期溫度偏高 ,菌體在短時間內生長可能會快 ,但容易衰老 ,表現為發(fā)酵前期短時間內 耗糖快 ,且耗糖速度很快就會下降 ,發(fā)酵周期要延長 ,谷氨酸生成少 。 在發(fā)酵中期 ,即菌體轉型階段 ,應將溫度提高到最適產酸溫度 ， 即發(fā)酵前期溫度控制在 33~34℃ ，中后期控制在 36~38℃。 2） PH 控制：在正常情況下 ,為了保證足夠的氮源 ,滿足菌體生長和谷氨酸合成的需要 ,通常將發(fā)酵 pH控制在稍微堿性的狀態(tài) 。 故前期 ， 8h 后 ~， 20~~，通過流加液氨進行調節(jié)發(fā)酵 pH。本設計提取谷氨酸采用等電點法 ,為了提取工序節(jié)省酸的用量 ,放罐時 pH 控制在 ~。 3）通風與 OD： 在菌體生長期 ,希望糖的消耗最大限度的用于合成菌體 ,谷氨酸生成期 ,希望糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸 。 供氧必須滿足菌體的需要量 。 一般根據凈增 OD 來控制通風。發(fā)酵前期， OD 長的快，耗糖越快，風量提得越高。發(fā)酵開始 3~4h，凈增 OD 時升一次風； 發(fā)酵 6~7h，凈增 OD 二 次風；發(fā)酵 6~8h時，凈增 OD ~時第三次風升至最大風量，之后控制凈增 OD ~ 左右，保持最大風量十幾小時，發(fā)酵 18~20h， RG降到 3%時，第一次降風； 發(fā)酵 22~23h， RG降到 2%以下，第 2 次降風； 發(fā) 酵25~26h， RG 降到 1%以下時，第三次降風 ， 到發(fā)酵零小時通風量接近，至發(fā)酵結束。 4）流加糖的控制 ： 雙酶法糖經濃縮后含糖 50%，總糖量為 40~45%作為流加糖量。 T613 菌種，流加液氨與 pH的控制為：第一次流加： pH 達高峰后下跌至 ~， 流加量為 %； 第二次流加： pH 達高峰后下跌至 ~， 流加量為 %。 21 發(fā)酵主期液氨流加：要求 pH 控制在 以下，流加量視殘?zhí)橇亢?pH 量而定，約每 1%殘?zhí)橇骷?%計，后期流加每次不超過 %。 5） 泡沫的控制 ： 發(fā)酵過程中，采用化學消泡為主 ，機械消泡為輔的消泡方法?；瘜W消泡劑用 BAPE 非離子表面活性劑，消泡能力強，用量少毒性低且使用方便。使用時先用水進行勾兌，比例為 1： 3。 6）殘?zhí)堑目刂?： 由于移種需要一定的時間，為了預防培養(yǎng)基營養(yǎng)缺乏導致菌體衰老，自溶，培養(yǎng)結束時應保證有一定濃度的殘?zhí)?，通常，培養(yǎng)結束時的殘?zhí)强刂圃?10~20g/L. 7）種齡與種量：種齡： 9~13h，過長，種子活力減低，代謝產物多。 種量：指培養(yǎng)好的種子液量占接入發(fā)酵培養(yǎng)基數量的百分比。取 10%為好。 ： 1）污染菌的檢查： 產菌球散開、菌絲變形、產酸不正常甚 至不產酸或“倒酸”、而糖卻大量