現(xiàn)代分子生物研究方法(編輯修改稿)
2025-02-12 09:55 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 5312 堿變性法 ? 在 pH值介于 ～ DNA溶液，線性 DNA會(huì)被變性，而閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA則不會(huì)被變性，盡管在這樣的條件下連接 DNA互補(bǔ)鏈之間的氫鍵也會(huì)斷開(kāi)，但由于閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤繞作用，互補(bǔ)的兩條鏈仍然會(huì)緊密地結(jié)合在一起。與此相反，線性 DNA的兩條鏈則會(huì)完全分開(kāi)。若用制冷或恢復(fù)中性的方法處理 DNA混合物，質(zhì)粒 DNA能迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，但隨機(jī)斷裂產(chǎn)生的線性染色體 DNA分子，彼此已經(jīng)分離的互補(bǔ)鏈之間的復(fù)性作用就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，往往聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)及 RNA一道被離心沉淀下來(lái)?？梢杂镁凭恋矸ㄊ占匀粶粼谏锨逡褐械馁|(zhì)粒 DNA。這目前最流行的方法。 532 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 5321pSC101質(zhì)粒載體 ? pSC101是低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有 1～ 2個(gè)拷貝。其分子大小為 kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因 (tetr)。該質(zhì)粒具有 EcoRI、 Hin dⅢ 、 Bam H I、 Sal I、Xho I、 Pvu Ⅱ 以及 Sma I等 7種限制性核酸內(nèi)切酶的單切割位點(diǎn)，在Hin dⅢ 、 Bam H I和 Sal I 等 3個(gè)位點(diǎn)克隆外源 DNA，都會(huì)導(dǎo)致 tetr基因失活。 ? pSClO1質(zhì)粒具有可插人外源 DNA的多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點(diǎn)，還具有四環(huán)素抗性的強(qiáng)選擇記號(hào)，便于篩選。因此，它第一個(gè)被選為真核基因的克隆載體。這個(gè)質(zhì)粒載體有其明顯的缺點(diǎn)，它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSClOl DNA，其產(chǎn)量就要比其他質(zhì)粒載體低得多。 5322 pBR322質(zhì)粒載體 ? 為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，有必要用人工的方法構(gòu)建一種既帶有多種抗藥性的強(qiáng)選擇記號(hào)，又具有低分子質(zhì)量、高拷貝以及外源 DNA插入不影響復(fù)制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)的新的質(zhì)粒載體。目前，在基因克隆中廣泛使用的 pBR322質(zhì)粒，就是按這種設(shè)想構(gòu)建的一種大腸桿菌質(zhì)粒載體。 ? pBR322質(zhì)粒是由 3個(gè)不同來(lái)源的部分組成的 :含有氨卡青霉素抗性基因（ ampr)、四環(huán)素抗性基因 (tetr)和 DNA復(fù)制起點(diǎn)(ori)(圖 522)。 ? pBR322質(zhì)粒載體較小 ,其長(zhǎng)度為 4363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段較大（ 68kb）的外源 DNA片段，操作起來(lái)仍較為便利。 ? pBR322質(zhì)粒載體具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)，方便選擇。例如，將外源 DNA克隆在 Bam H I位點(diǎn)上，將這樣的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌細(xì)胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上，那么存活下來(lái)的菌落都將具有 Ampr的表型，它們也必定是獲得了編碼有這種抗性基因的轉(zhuǎn)化子。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可累積 1000～ 3000個(gè)拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。 533 λ噬菌體載體 ? 噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文名叫作bacteriophage，來(lái)源于希臘文“ phagos”，系指吞噬之意。如同質(zhì)粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴(kuò)增特定的 DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。作為細(xì)菌寄生物的噬菌體，它可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了寄主細(xì)胞，就既不能生長(zhǎng)也不能復(fù)制，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)的噬菌體只能利用寄主核糖體、合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進(jìn)行生長(zhǎng)和增殖。 ? 噬菌體有兩種類型： ? 溶菌周期（烈性噬菌體）：噬菌體將其感染的寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。 ? 溶源生長(zhǎng)周期（溫和噬菌體）：在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體 DNA被整合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。 ? 以噬菌體 DNA分子作載體，克隆含有目的基因的外源 DNA片段，只要不導(dǎo)致重要的噬菌體基因失活，這種重組的噬菌體 DNA感染了寄主細(xì)胞之后，插入的外源 DNA片段便會(huì)隨著噬菌體 DNA分子一道增殖。可按照類似于制備質(zhì)粒 DNA的方法，分離到大量的重組體噬菌體 DNA，實(shí)現(xiàn)克隆基因的擴(kuò)增。 ? λ噬菌體的分子為 ，是一種中等大小的溫和噬菌體。迄今已經(jīng)定位的 λ噬菌體基因至少有 61個(gè)，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的調(diào)控（必需基因） 。另一部分基因則被稱為非必需基因；當(dāng)它們被外源基因取代之后，不影響噬菌體的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重組噬菌體 DNA，可以隨寄主細(xì)胞一起被復(fù)制和增殖。 ? 在 λ噬菌體線性雙鏈 DNA分子的兩端，各有一條由12個(gè)核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的 5?單鏈突出序列（粘性末端）。當(dāng) λ噬菌體的線性 DNA分子注入到被感染寄主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，會(huì)通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后在 DNA連接酶的作用下，將相鄰的 5? P和 339。OH基團(tuán)封閉起來(lái)。這種粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為 cos位點(diǎn) cohesiveend site，粘性末端位點(diǎn) )。 ? 野生型的 λ噬菌體 DNA具有太多的常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)（ 5個(gè) Eco R I酶切位點(diǎn)和7個(gè) Hin d Ⅲ 酶切
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