【文章內(nèi)容簡介】 的功能單位，它也是一個順反子。l Benzer通過順反測驗表明：– 100多個 rII突變型可以分為 A、 B兩組，組間突變型間能夠突變，而組內(nèi)的突變型間不能互補(bǔ)；– 與 rII區(qū)段連鎖圖對照發(fā)現(xiàn)：兩組突變分別位于 rII區(qū)段的兩端 | A | B |。rII的兩個順反子l 經(jīng)典遺傳學(xué)意義上的一個基因(rII區(qū)段 )實際上有兩個順反子 (功能單位 )。l 因此基因也很可能不是遺傳的最小功能單位。l 有些基因具有一個順反子，有些基因具有多個順反子。l 在多順反子情況下，基因是幾個功能單位的復(fù)合體。l Benzer提出 “一個順反子一條多肽鏈 ”。四、 現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念(一 )、 現(xiàn)代基因概念l 基因是 DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段。l 基因由重組子、突變子序列構(gòu)成的。– 重組子是 DNA重組的最小可交換單位；– 突變子是產(chǎn)生突變的最小單位；– 重組子和突變子都是一個核苷酸對或堿基對 (bp)。l 基因可以包含多個功能單位 (順反子 )。(二 )、 基因的功能類型l 根據(jù)基因的原初功能可以將基因分為：1. 編碼蛋白質(zhì)的基因，即有翻譯產(chǎn)物的基因。– 如結(jié)構(gòu)蛋白、酶等 結(jié)構(gòu)基因 和產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白的 調(diào)節(jié)基因 。2. 沒有翻譯產(chǎn)物，不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因。– 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA不翻譯，如編碼 tRNA、 rRNA。3. 不轉(zhuǎn)錄的 DNA區(qū)段。– 如啟動基因、操縱基因。啟動基因是轉(zhuǎn)錄時 RNA多聚酶與 DNA結(jié)合的部位。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與 DNA結(jié)合的部位。(三 )、 基因的幾種特殊形式l 1. 重復(fù)基因：– 指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復(fù)基因往往是生命活動中最基本、最重要的功能相關(guān)的基因。– 最典型的重復(fù)基因是 rRNA、 tRNA和組蛋白基因等。l 2. 重疊基因：– 同一段 DNA序列，由于閱讀框架 (轉(zhuǎn)錄范圍 )不同，同時成為兩個或兩個以上基因的組成部分。– 因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個基因完全存在于另一個基因內(nèi)部。3. 斷裂基因或隔裂基因l 生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)。 1977年 Doel研究表明：– 卵清蛋白基因中間存在不表達(dá)的堿基序列，表明基因的 DNA序列可能是不連續(xù)的。– 外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的 DNA片段；– 內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的 DNA片段。l 真核生物基因可能是不同外顯子的組合 —— 斷裂基因。4. 跳躍基因 (jumping gene)l 又稱為轉(zhuǎn)座子 (transposon)、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子 (transposable element)。– 生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)還認(rèn)為基因在染色體上的相對位置是固定的。– 后來發(fā)現(xiàn)某些 DNA序列可以在染色體上轉(zhuǎn)變位置。– 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位的過程也是一個遺傳重組過程；– 轉(zhuǎn)座子在染色體上轉(zhuǎn)位可能會引起插入位置基因功能喪失 (突變 )，再次轉(zhuǎn)位離開插入點時便會發(fā)生基因功能的恢復(fù)。第五節(jié) 基因突變的分子機(jī)制一、 locus與 site二、 基因突變的類型三、 DNA的防護(hù)機(jī)制四、 DNA修復(fù)與突變的產(chǎn)生五、化學(xué)因素誘變的分子機(jī)制一、 locus與 sitel 經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：– 基因是染色體上的一個點，稱位點 (site)。l 現(xiàn)代基因概念認(rèn)為：– 基因是 DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區(qū)段；– 基因是由眾多堿基對構(gòu)成，此時將一個堿基對稱為基因的一個 位點 (site)；– 而將基因在染色體上的位置則稱為 座位(locus)。二、 基因突變的類型1. 根據(jù)突變所引起的表型改變分為：– 形態(tài)突變型；– 生化突變型；– 致死突變型；– 條件致死突變型。2. 根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式：– 堿基替換突變；– 堿基倒位；– 移碼 (插入與缺失 )突變。二、 基因突變的類型3. 從 DNA堿基序列改變的多少：– 單點突變 (替換 )；與經(jīng)典遺傳學(xué)的點突變 point mutation比較 .– 多點突變 (移碼 )。4. 從突變所引起的遺傳信息意義的改變：– 同義突變；– 錯義突變；– 無義突變。第六節(jié) 遺傳工程一、 遺傳工程概述*二、 染色體工程*三、 細(xì)胞工程四、 基因工程一、 遺傳工程概述l 遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上：– 解釋、研究 生物進(jìn)化 的原因、過程和規(guī)律 (遺傳與進(jìn)化 )。– 改善動、植物和微生物的遺傳特性 —— 按照人類的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類型、新品種的 人工進(jìn)化 過程 (育種學(xué) )。育種工作的理論和技術(shù)水平在很大程度上取決于遺傳學(xué)所取得的成就。l 訖今為止，動、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細(xì)胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎(chǔ)所取得的。– 六、七十年代的綠色革命；– 育種工作面臨的問題。一、 遺傳工程概述(一 )、 遺傳工程的基礎(chǔ)l 人類對自然改造的能力取決于對自然規(guī)律的認(rèn)識水平。分子遺傳、生物化學(xué)及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展使生物遺傳操作的能力正在不斷提高。l 遺傳工程的理論與技術(shù)基礎(chǔ)主要來自于：1. 分子遺傳學(xué)的理論；2. 生物化學(xué)及分子生物學(xué)的成就；3. 細(xì)胞生物學(xué)理論和技術(shù)。(二 )、 遺傳工程的含義l 生物技術(shù)l 生物工程：– 遺傳工程；– 蛋白質(zhì)工程、酶工程；– 微生物工程；– ……l 遺傳工程：在分子遺傳理論、技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過工程設(shè)計與施工方式，從細(xì)胞、分子水平改造生物遺傳特性。l 作為一個綜合性的技術(shù)群體系， 廣義的遺傳工程 包含許多相關(guān)的組成部分，其主要的部分有三個：– 1. 染色體工程；– 2. 細(xì)胞工程；– 3. 基因工程。l 狹義的遺傳工程 指的是基因工程。*三、細(xì)胞工程l 細(xì)胞工程的主要技術(shù)和研究領(lǐng)域包括：– 細(xì)胞、原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)；– 細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生 ；– 體細(xì)胞 無性系變異 的誘導(dǎo)、篩選與應(yīng)用；– 以細(xì)胞、原生質(zhì)體作為 基因工程受體 ；– 細(xì)胞、原生質(zhì)體 融合、 雜種細(xì)胞篩選、鑒定與應(yīng)用 。(一 )、細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生l 采用體細(xì)胞雜交在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移與應(yīng)用的必要條件是：細(xì)胞、原生質(zhì)體遺傳全能性能充分實現(xiàn)， 再生 成新的生物個體。l 對 植物 而言，細(xì)胞和原生質(zhì)體再生技術(shù)已經(jīng)比較成熟。– 曾經(jīng)是人們公認(rèn)難題的禾本科植物原生質(zhì)體再生在近二十多年來也已取得巨大進(jìn)展。l 對 動物 而言，克隆羊 “多利 ”的誕生表明：動物細(xì)胞 (包括人體細(xì)胞 )再生成為個體都是可能，其技術(shù)實現(xiàn)需要的僅僅是時間。(二 )、植物原生質(zhì)體作為基因工程的受體l 最初常用的轉(zhuǎn)基因受體有 葉圓片、幼胚、愈傷組織 等植物組織器官。l 在這些組織、器官中：– 細(xì)胞壁的存在會增加操作的難度；– 產(chǎn)生細(xì)胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選 轉(zhuǎn)化子 。l 因此原生質(zhì)體是最具潛力的植物基因工程受體，轉(zhuǎn)化效率高、篩選方便。(三 )、細(xì)胞、原生質(zhì)體融合l 采用細(xì)胞、原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，通過誘導(dǎo)再生獲得雜種個體 (雙二倍體 )，可 避免有性雜交障礙 。l 動物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁，細(xì)胞融合技術(shù)較植物成熟和成功。當(dāng)然動物細(xì)胞融合都局限于獲得雜種細(xì)胞及其無性細(xì)胞系。– 可以預(yù)見：用雜種細(xì)胞核代替 維爾 穆特 獲得克隆羊所采用的乳腺細(xì)胞核可以獲得物種間雜種生物個體。– 人與小鼠雜種細(xì)胞的無性細(xì)胞系曾在人類基因染色體定位研究上發(fā)揮重要的作用。l 植物細(xì)胞融合由于細(xì)胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細(xì)胞壁分離原生質(zhì)體的技術(shù)是植物細(xì)胞雜交的基礎(chǔ)。獲得雜種細(xì)胞及其再生植株后，即可進(jìn)行 物種間細(xì)胞核、染色體以及細(xì)胞器 的轉(zhuǎn)移?；蚬こ? 所謂的遺傳工程就是在分子水平上，用人工方法提?。ɑ蚝铣桑┎煌锏倪z傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合。然后通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細(xì)胞，使外源ＤＮＡ在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。按人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。所以基因工程（ gene engineering）也稱為遺傳工程（ geic engineering）、基因操作（ gene manipulation）、ＤＮＡ重組技術(shù)（ rebination DNA techniques）。有時人們還稱它為基因克?。?gene cloning）或分子克隆（ molecular cloning）。? 遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細(xì)胞，克隆轉(zhuǎn)化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測等。 第一節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)一、限制性核酸內(nèi)切酸（ restriction endonuclease）：? 這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶（ restriction enzyme）。限制性內(nèi)切酶本來是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶 ：分子量較大，反應(yīng)需 Mg++、 S腺苷酰 L甲硫氨酸（ SAM）、 ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，所以在基因工程中應(yīng)用不大。Ⅱ 型酶 ：分子量較?。?105Da），反應(yīng)只需 Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。?識別位點是一個回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。?許多 Ⅱ 型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。Ⅲ 型酶 ：這類酶可識別特定順序，并在這一順序的 3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。 同裂酶 （ isoschizomers)： 指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂、酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶 （ isocaudamer）： 指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例： EcoR I: 來自于 Escheria coli RY13的第一個限制酶。二、末端轉(zhuǎn)移酶（ terminal transferase）? 該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應(yīng)與DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３ ’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３ ’－ＯＨ端加入核苷酸達(dá)幾百個。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（ linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結(jié)構(gòu)。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端 DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。 Hpa II Hpa IIBamH I 或 Sau3A三、ＤＮＡ連接酶（ DNA ligase）? 該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結(jié)合起來。 DNA連接酶對具有粘性末端的 DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的 DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。 四、反轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase）? 這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以ＲＮＡ為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（ AMV）及鼠源（ MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。五、 DNA pol I及 Klenow片段? 該酶常用于制備放射性比度比活體標(biāo)記高得多的ＤＮＡ探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（ nick translation）法制備的。 該酶還用于裂口（ gap）修補(bǔ)、反轉(zhuǎn)錄第二條鏈的合成（ Klenow ）、隱蔽末端的填平反應(yīng)（ Klenow ）等。Klenow片段 ： DNA pol I 用枯草桿菌蛋白酶水解成兩個片段，小片段（ 36KD）具有 5’ 3’ 核酸外切酶活性，大片段（ 76KD）稱為 Klenow片段，具有 DNA鏈聚合及 3’ 5’核酸外切酶的