【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 動(dòng)脈壁內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增生和血栓的形成，減少氧化低密度脂蛋白，抑制膽固醇在體內(nèi)的合成，促進(jìn)膽固醇的代謝，因而能保持人體正常的血脂水平和保證血流順暢，對(duì)人體心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用（李婕姝等 2022）。 (6) 對(duì)消化系統(tǒng)的作用 石榴果皮中由于含大量鞣質(zhì)，能凝固或沉淀蛋白質(zhì)，有助于局部創(chuàng)面愈合和保護(hù)其免受刺激，因而有止血、澀腸的功能 [7]（李海霞和王釗 2022），并且能驅(qū)除腸道內(nèi)的寄生蟲(chóng)、避免腹瀉、抑制大腸桿菌等致 病菌的生長(zhǎng)及避免腸毒素的產(chǎn)生 [10]（任平等 2022）。另外，石榴皮還能減少胃潰瘍的發(fā)病率，保護(hù)胃部免受藥物和酒精等的刺激。動(dòng)物試驗(yàn)表明石榴果皮的水提液具有治療家兔消化機(jī)能紊亂引起的腹瀉的作用（張杰等 1996）。 北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 5 (7) 抗老化和防曬美白 植物多酚的較強(qiáng)的紫外吸收在 200～ 300nm 之間 [11]，特別是對(duì)遠(yuǎn)紫外區(qū)的吸收作用很好，還能夠阻止生成皮膚黑色素，有助于美白皮膚（趙揚(yáng)帆和鄭寶東 2022）。因此植物多酚被稱(chēng)為植物體內(nèi)的“紫外線(xiàn)過(guò)濾器”（阮志平 2022）。 石榴皮的研究進(jìn)展 石榴的經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高 ,在工業(yè)、食品、醫(yī)藥、園林綠化等多個(gè)領(lǐng)域都有重要用途。如石榴根皮、樹(shù)皮及果皮因較高的鞋質(zhì)含量 ,常用于制革工業(yè)等 [12],成為化工產(chǎn)品的重要原材料；石榴葉含豐富的維生素、礦物質(zhì)和活性成份 ,制成的石榴葉保健茶具有防暑降溫、爽心明目、健胃怡神等多種功效；石榴種子含豐富的油脂 ,具有很高的食用價(jià)值 ,其籽油和提取物可開(kāi)發(fā)成功能保健品；石榴果實(shí)可用來(lái)制造飲料、果酒等；石權(quán)又含多種活性成分 ,其根、葉、花、果等均可作為藥材；此外 ,樹(shù)姿優(yōu)美 ,枝葉秀麗 ,花色艷麗 ,是很好的園林觀賞樹(shù)種 [13]。 國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道， 石榴皮中含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)等化學(xué)成分 [14]。目前為止，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)石榴化學(xué)成分的研究報(bào)道多以云南、山東等地產(chǎn)的石榴為主，研究對(duì)象也多是石榴葉、石榴籽和石榴花，對(duì)石榴皮的研究報(bào)道較少。石榴皮為石榴加工廢料 , 目前除少數(shù)藥用外 , 大多未加以利用 , 探尋石榴皮加工利用的途徑和方法 , 具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值 [15]。為此，本項(xiàng)目以山東玻璃翠、山東大馬牙、山東青皮、新疆和田、新疆喀什、新疆皮亞曼這六種石榴皮為材料，從提取分離有效成分入手，研究其化學(xué)成分，并通過(guò)現(xiàn)代波普技術(shù)結(jié)合化學(xué)方法測(cè)定石榴皮提 取物中總酚、總黃酮、鞣花酸的含量及分析其提取物的體外抗氧化活性。 北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 6 2 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)材料 山東玻璃翠（ SDBLC）、山東大馬牙（ SDDMY）、山東青皮（ SDQP）、新疆和田（ XJHT）、新疆喀什（ XJKS）、新疆皮亞曼（ XJPYM） (六種石榴皮 ) 。稱(chēng)取陰干的石榴皮 100g，粉碎，裝入自封袋，干燥保存，備用。 實(shí)驗(yàn)試劑 無(wú)水甲醇、蒸餾水、碳酸鈉、 ALCL3 6H2O、 NaOH、 磷酸 、 98%濃硫酸、 37%濃鹽酸購(gòu)于北京化工廠；沒(méi)食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； FC 試劑、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品、 DPPH粉末、 ABTS 粉末購(gòu)于美國(guó) SIGMA 公司； 純乙腈 ， 色譜甲醇 為色譜純，購(gòu)于天津市康科德科技有限公司； TroLox，購(gòu)于 Beijing Thman BiotechnoLogy .；鐵氰化鉀 [K3Fe(CN)6]，分析純，購(gòu)于天津市津科精細(xì)化工研究所；三氯乙酸，分析純，購(gòu)于北京市興津化工廠；三氯化鐵，分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司。 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 FW135 中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀 器有限公司； 電熱恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司； N1100DW 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器， SB1100 水浴鍋，上海愛(ài)明儀器有限公司； SHZⅢ 型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠； ML104/02 電子天平，上海方瑞儀器有限公司； UV1700 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司； LC20A 高效液相色譜儀，日本島津公司； DHG9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司； TS2 搖床， KyLinBeLL Lab Instrument。 實(shí)驗(yàn)方法 石榴皮 游離態(tài) 多酚的提取 50 g 石榴皮粉末，加 400 mL， 80%甲醇， 80℃ 加熱回流提取 1 h，冷卻后過(guò)濾，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并兩次濾液 ，定容至 800 mL。殘?jiān)L(fēng)櫥揮干有機(jī)溶劑 ，然后 60℃烘干 。取出 200 mL 提取液，減壓濃縮 后放入蒸發(fā)皿中烘干（計(jì)算干物質(zhì)重量，空皿提前稱(chēng)重） 計(jì)算得率。 北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 7 總酚含量測(cè)定 TPC 方法 以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品采用福林 (FoLinCiocaiLeu) 法測(cè)定石榴 皮 中總酚含量。福林試劑，蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍(lán)色（生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物） 。藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比， 可用比色法測(cè)定 [19]。 (1) 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確稱(chēng)取 g 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，蒸餾水溶解并定容至 50 mL 容量瓶。該標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 mg/mL。 準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0、 、 、 、 、 、 于 5 mL 離心管中，各加 3 mL 蒸餾水，搖勻，再加 mL FC 試劑，充分搖勻。 5min 之后，加入碳酸鈉溶液 (20 %) mL，混勻定容至 5mL。避光靜止 90 min， 每個(gè)樣品平行測(cè)定三次， 于 760 nm 波長(zhǎng)下比色 [20]，測(cè)定吸光度， 以沒(méi)食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 (2) 石榴皮提取液的總酚含量測(cè)定（ 取果皮原液稀釋 30 倍） 用移液槍精確量取稀釋好的樣品溶液 mL 于 5 mL 離心管中， 按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法測(cè)定樣品反應(yīng)液在 765 nm 波長(zhǎng)下的吸光值 , 用回歸方程計(jì)算總酚含量 。（注意每個(gè)樣品重復(fù)做三次，測(cè)得的 OD 值取平均值 ， 被測(cè)樣品溶液中的沒(méi)食子酸含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中讀出，總 酚 含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示 ） 。 總黃酮測(cè)定 TFC 測(cè)定 黃酮母核中含有堿性氧原子，一般又多 帶酚羥基，能與鋁離子，產(chǎn)生黃色絡(luò)合物，又加入 NaNO2和 NaOH 溶液，使在堿性溶液中呈紅色，使在堿性溶液中呈紅色，溶液在 510 nm 處有最大吸收，顯色反應(yīng)在 60min 內(nèi)穩(wěn)定 [21]。 (1) 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確稱(chēng)取 g 蘆丁 準(zhǔn)樣品，蒸餾水溶解并定容至 50 mL容量瓶。該標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 mg/mL[22]。準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0、 、 、 、 、 mL 于 5 mL 離心管中，加 2 mL 蒸餾水，再加 mL 5% NaNO2溶液， 6min后，加 10% ALCL36H2O 溶液， 5 min后，加 2 mL of 1 M NaOH，蒸餾水補(bǔ)至終體積 5 mL。搖勻后，靜置 30 min。 510 nm 下，讀取 OD 值 [23]。 以蘆丁在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 (2) 石榴皮提取液的總黃酮含量測(cè)定（果皮提取液稀釋 10 倍）。 用移液槍精確量取稀釋好的樣品溶液 mL 于 5 mL 離心管中，同上?？傸S酮含量以蘆丁當(dāng)量(rutin equivaLent, RE)表示。 北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 8 鞣花酸含量的測(cè)定 鞣花酸 (eLLagic acid， EA)為石榴皮中的有效成份之一，具有抵抗肺癌、食管癌、抗氧化等作用閉。目前，國(guó)外正在開(kāi)發(fā)以鞣花酸為原料的保健食品與藥物。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)研究報(bào)告，高效液相色譜法一種有效的測(cè)定鞣花酸含量的方法 [24]。 (1) 液相條件 島津 LC20AHPLC， SPD20AUV 檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器；迪馬色譜分析分析柱 (250 mm5 181。m)。流速 : mL/min；進(jìn)樣量 :20181。L；波長(zhǎng)： 254 nm；流動(dòng)相 A:B=81:19(其中 A 相為 %磷酸水， B 相為純乙腈 )。 (2) 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 精 密稱(chēng)取 10mg 鞣花酸對(duì)照品，置于 100 mL 容量瓶中，加入 50 mL 色譜甲醇超聲溶解，再以色譜甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻后以 181。m 過(guò)濾器濾過(guò)，即得 濃度為 mg/mL 的 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取 2 mL、 1 mL、 mL、 mL、 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液置于 100 mL 容量瓶中，同樣 用 色譜甲醇稀釋至刻度，搖 勻 ，配制成一系列濃度的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (， ， ， ， 181。g/mL)。進(jìn)樣量： 20 181。Ｌ，記錄色譜峰面積，以鞣花酸 (181。g/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制鞣花酸 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) [25]。 (3) 石榴皮提取液的鞣花酸含量測(cè)定 在上述的色譜條件下，吸取一定量的樣品溶液 加入 50%甲醇溶液稀釋至一定濃度，過(guò) 181。m濾膜，進(jìn) HPLC 測(cè)定。 石榴皮 游離態(tài)多酚提取液 的抗氧化活性評(píng)價(jià) 清除 DPPH 自由基能力測(cè)定 DPPH 自由基清除能力按照 ALasdvar 等 (2022)的方法進(jìn)行測(cè)定 [29]，將待測(cè)樣品稀釋至 40320 ug/mL 濃度范圍內(nèi)。具體步驟為 : (1) 實(shí)驗(yàn)試劑的配制 DPPH 溶液：取 gDPPH 粉末，用甲醇溶解至 50mL，得到 DPPH 溶液（ 1 mmoL/L） 。 TroLox 溶液：取 gTroLox 粉末用甲醇及蒸餾水溶解至 50 mL，得到 1 mg/mL 的 TroLox 溶液。 (2) TroLox 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 將 1 mg/mL 的 TroLox 溶液稀釋至 、 、 、 、 、 、 mg/mL，分別取 mL于 5 mL 離心管中，加入 mL 用甲醇新鮮配置的 DPPH 溶液，再加入 2 mL 甲醇，搖勻后避光靜北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 9 置 20 min，在 517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 (3) 石榴皮提取液的清除 DPPH 自由基能力測(cè)定 將 6 個(gè)品種的石榴皮提取液分別稀釋 200 倍、 100 倍、 50 倍、 40 倍、 30 倍、 20 倍，再分別取無(wú)水甲醇、原液及不同稀釋倍數(shù)的溶液 mL 于 5 mL 離心管中，加入 mLDPPH 溶液和 2 mL甲醇，搖勻后避光靜置 20 min，以純甲醇為空白對(duì)照，在 517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次求平均自由基清除率。 DPPH 自由基清除率： RSA(%)=(1AS/A0)*100% 其中， RSA(%)是 DPPH 自由基清除率， A0 是 mLDPPH+ mL 甲醇在 517 nm 處的吸光值，AS 是 mLDPPH+ mL 樣品溶液 +2mL 甲醇在 517 nm 處的吸光值。 清除 ABTS 自由基能力測(cè)定 (1) 實(shí)驗(yàn)試劑的配制 ABTS 儲(chǔ)備液：稱(chēng)量 gABTS 粉末，用蒸餾水定容至 25 mL 容量瓶中，配得 7 mmoL/L 的ABTS+溶液。稱(chēng)量 g 的過(guò)硫酸鉀，用蒸餾水定容至 5 mL 容量瓶中，配得 140 mmoL/L 的過(guò)硫酸鉀溶液。分別取 25 mLABTS 溶液和 過(guò)硫酸鉀溶液使之以 :1 的比例混合，室溫下避光靜置 16 h，制的 ABTS 自由基陽(yáng)離子 （ ABTS+）儲(chǔ)備液。 ABTS+工作液：使用前將 ABTS+儲(chǔ)備液和無(wú)水甲醇以 1:48 的比例稀釋?zhuān)玫?ABTS+工作液， 4 mL 工作液 +1 mL 無(wú)水甲醇混合后在 734 nm 波長(zhǎng)處吸光度為 177。 時(shí)工作液合格。 (2) TroLox 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 將 1 mg/mLTroLox 溶液稀釋至 、 、 、 、 、 、 mg/mL，分別取這些不同濃度的 TroLox 溶液 mL 于 5mL 離心管中，再分別加入 mL 新鮮配置的 ABTS+工作液，混勻后避光靜置 6~10 min，最后在 734 nm 處測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 (3) 石榴皮提取液的清除 ABTS 自由基能力測(cè)定 將 6 個(gè)品種的石榴皮提取液分別稀釋 1000 倍、 500 倍、 200 倍、 100 倍、 50 倍 ，然后取不同稀釋倍數(shù)的樣品溶液 mL 于 5mL 離心管中，加入 mL 新鮮配置的 ABTS+工作液，搖勻，靜置6~10 min，在 734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光值。重復(fù)三次求平均 ABTS+自由基清除率。 ABTS+自由基清除率： RSA(%)=(1AS/A0)*100% 其中， RSA(%)是 ABTS+自由基清除率， A0是 mL ABTS+工作液 + mL 甲醇在 734 nm 處的吸光值， AS是 mL ABTS+工作液 + mL 樣品溶液在 734 nm 處的吸光值。 北京林業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 10 鐵氰化鉀還原力測(cè)定 （ FRAP） (1) 實(shí)驗(yàn)試劑的配制 磷酸緩沖液：首先應(yīng)配制 Na2HPO4和 NaH2PO4，取 ，用蒸餾水定容至 250mL；取 ，用蒸餾水定容至 250mL。然后分別取 溶液及 溶液混合搖勻，得到 100mL 磷酸緩沖液（ 、 ）。 鐵氰化鉀 [K3Fe(CN)6]溶液：取 1g 鐵氰化鉀粉末，用蒸餾水定容至 100mL，得到 1%的鐵氰化