【文章內(nèi)容簡介】 動脈壁內(nèi)平滑肌細胞的增生和血栓的形成，減少氧化低密度脂蛋白，抑制膽固醇在體內(nèi)的合成，促進膽固醇的代謝，因而能保持人體正常的血脂水平和保證血流順暢，對人體心血管系統(tǒng)起到保護作用（李婕姝等 2022）。 (6) 對消化系統(tǒng)的作用 石榴果皮中由于含大量鞣質(zhì)，能凝固或沉淀蛋白質(zhì)，有助于局部創(chuàng)面愈合和保護其免受刺激，因而有止血、澀腸的功能 [7]（李海霞和王釗 2022），并且能驅(qū)除腸道內(nèi)的寄生蟲、避免腹瀉、抑制大腸桿菌等致 病菌的生長及避免腸毒素的產(chǎn)生 [10]（任平等 2022）。另外，石榴皮還能減少胃潰瘍的發(fā)病率，保護胃部免受藥物和酒精等的刺激。動物試驗表明石榴果皮的水提液具有治療家兔消化機能紊亂引起的腹瀉的作用（張杰等 1996）。 北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 5 (7) 抗老化和防曬美白 植物多酚的較強的紫外吸收在 200～ 300nm 之間 [11]，特別是對遠紫外區(qū)的吸收作用很好，還能夠阻止生成皮膚黑色素，有助于美白皮膚（趙揚帆和鄭寶東 2022）。因此植物多酚被稱為植物體內(nèi)的“紫外線過濾器”（阮志平 2022）。 石榴皮的研究進展 石榴的經(jīng)濟價值很高 ,在工業(yè)、食品、醫(yī)藥、園林綠化等多個領(lǐng)域都有重要用途。如石榴根皮、樹皮及果皮因較高的鞋質(zhì)含量 ,常用于制革工業(yè)等 [12],成為化工產(chǎn)品的重要原材料；石榴葉含豐富的維生素、礦物質(zhì)和活性成份 ,制成的石榴葉保健茶具有防暑降溫、爽心明目、健胃怡神等多種功效；石榴種子含豐富的油脂 ,具有很高的食用價值 ,其籽油和提取物可開發(fā)成功能保健品；石榴果實可用來制造飲料、果酒等；石權(quán)又含多種活性成分 ,其根、葉、花、果等均可作為藥材；此外 ,樹姿優(yōu)美 ,枝葉秀麗 ,花色艷麗 ,是很好的園林觀賞樹種 [13]。 國內(nèi)外研究報道， 石榴皮中含有黃酮類、生物堿類、有機酸類、鞣質(zhì)類等化學成分 [14]。目前為止，國內(nèi)學者對石榴化學成分的研究報道多以云南、山東等地產(chǎn)的石榴為主，研究對象也多是石榴葉、石榴籽和石榴花，對石榴皮的研究報道較少。石榴皮為石榴加工廢料 , 目前除少數(shù)藥用外 , 大多未加以利用 , 探尋石榴皮加工利用的途徑和方法 , 具有重要的社會、經(jīng)濟價值 [15]。為此，本項目以山東玻璃翠、山東大馬牙、山東青皮、新疆和田、新疆喀什、新疆皮亞曼這六種石榴皮為材料，從提取分離有效成分入手，研究其化學成分，并通過現(xiàn)代波普技術(shù)結(jié)合化學方法測定石榴皮提 取物中總酚、總黃酮、鞣花酸的含量及分析其提取物的體外抗氧化活性。 北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 6 2 材料與方法 實驗材料與設(shè)備 實驗材料 山東玻璃翠（ SDBLC）、山東大馬牙（ SDDMY）、山東青皮（ SDQP）、新疆和田（ XJHT）、新疆喀什（ XJKS）、新疆皮亞曼（ XJPYM） (六種石榴皮 ) 。稱取陰干的石榴皮 100g，粉碎，裝入自封袋，干燥保存，備用。 實驗試劑 無水甲醇、蒸餾水、碳酸鈉、 ALCL3 6H2O、 NaOH、 磷酸 、 98%濃硫酸、 37%濃鹽酸購于北京化工廠；沒食子酸、蘆丁標準品購于國藥集團化學試劑有限公司； FC 試劑、鞣花酸標準品、 DPPH粉末、 ABTS 粉末購于美國 SIGMA 公司； 純乙腈 ， 色譜甲醇 為色譜純，購于天津市康科德科技有限公司； TroLox，購于 Beijing Thman BiotechnoLogy .；鐵氰化鉀 [K3Fe(CN)6]，分析純，購于天津市津科精細化工研究所；三氯乙酸，分析純，購于北京市興津化工廠；三氯化鐵，分析純，購于西隴化工股份有限公司。 實驗設(shè)備 FW135 中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀 器有限公司； 電熱恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表公司； N1100DW 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器， SB1100 水浴鍋，上海愛明儀器有限公司； SHZⅢ 型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠； ML104/02 電子天平，上海方瑞儀器有限公司； UV1700 紫外分光光度計，日本島津公司； LC20A 高效液相色譜儀，日本島津公司； DHG9240A 電熱鼓風干燥箱，上海恒科學儀器有限公司； TS2 搖床， KyLinBeLL Lab Instrument。 實驗方法 石榴皮 游離態(tài) 多酚的提取 50 g 石榴皮粉末，加 400 mL， 80%甲醇， 80℃ 加熱回流提取 1 h，冷卻后過濾，殘渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液 ，定容至 800 mL。殘渣通風櫥揮干有機溶劑 ，然后 60℃烘干 。取出 200 mL 提取液，減壓濃縮 后放入蒸發(fā)皿中烘干（計算干物質(zhì)重量，空皿提前稱重） 計算得率。 北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 7 總酚含量測定 TPC 方法 以沒食子酸為標準品采用福林 (FoLinCiocaiLeu) 法測定石榴 皮 中總酚含量。福林試劑，蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物） 。藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比， 可用比色法測定 [19]。 (1) 總酚標準曲線的繪制 精確稱取 g 沒食子酸標準樣品，蒸餾水溶解并定容至 50 mL 容量瓶。該標準液濃度為 mg/mL。 準確量取上述標準液 0、 、 、 、 、 、 于 5 mL 離心管中，各加 3 mL 蒸餾水，搖勻，再加 mL FC 試劑，充分搖勻。 5min 之后，加入碳酸鈉溶液 (20 %) mL，混勻定容至 5mL。避光靜止 90 min， 每個樣品平行測定三次， 于 760 nm 波長下比色 [20]，測定吸光度， 以沒食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。 (2) 石榴皮提取液的總酚含量測定（ 取果皮原液稀釋 30 倍） 用移液槍精確量取稀釋好的樣品溶液 mL 于 5 mL 離心管中， 按上述標準曲線制作方法測定樣品反應(yīng)液在 765 nm 波長下的吸光值 , 用回歸方程計算總酚含量 。（注意每個樣品重復(fù)做三次，測得的 OD 值取平均值 ， 被測樣品溶液中的沒食子酸含量可從標準曲線中讀出，總 酚 含量以沒食子酸當量表示 ） 。 總黃酮測定 TFC 測定 黃酮母核中含有堿性氧原子，一般又多 帶酚羥基，能與鋁離子，產(chǎn)生黃色絡(luò)合物，又加入 NaNO2和 NaOH 溶液，使在堿性溶液中呈紅色，使在堿性溶液中呈紅色，溶液在 510 nm 處有最大吸收，顯色反應(yīng)在 60min 內(nèi)穩(wěn)定 [21]。 (1) 總黃酮標準曲線的繪制 精確稱取 g 蘆丁 準樣品，蒸餾水溶解并定容至 50 mL容量瓶。該標準液濃度為 mg/mL[22]。準確量取上述標準液 0、 、 、 、 、 mL 于 5 mL 離心管中，加 2 mL 蒸餾水，再加 mL 5% NaNO2溶液， 6min后，加 10% ALCL36H2O 溶液， 5 min后，加 2 mL of 1 M NaOH，蒸餾水補至終體積 5 mL。搖勻后，靜置 30 min。 510 nm 下，讀取 OD 值 [23]。 以蘆丁在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。 (2) 石榴皮提取液的總黃酮含量測定（果皮提取液稀釋 10 倍）。 用移液槍精確量取稀釋好的樣品溶液 mL 于 5 mL 離心管中，同上?？傸S酮含量以蘆丁當量(rutin equivaLent, RE)表示。 北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 8 鞣花酸含量的測定 鞣花酸 (eLLagic acid， EA)為石榴皮中的有效成份之一，具有抵抗肺癌、食管癌、抗氧化等作用閉。目前，國外正在開發(fā)以鞣花酸為原料的保健食品與藥物。據(jù)有關(guān)文獻研究報告，高效液相色譜法一種有效的測定鞣花酸含量的方法 [24]。 (1) 液相條件 島津 LC20AHPLC， SPD20AUV 檢測器，自動進樣器；迪馬色譜分析分析柱 (250 mm5 181。m)。流速 : mL/min；進樣量 :20181。L；波長： 254 nm；流動相 A:B=81:19(其中 A 相為 %磷酸水， B 相為純乙腈 )。 (2) 鞣花酸標準曲線的制作 精 密稱取 10mg 鞣花酸對照品，置于 100 mL 容量瓶中，加入 50 mL 色譜甲醇超聲溶解，再以色譜甲醇補足至刻度，搖勻后以 181。m 過濾器濾過，即得 濃度為 mg/mL 的 鞣花酸標準品溶液。分別吸取 2 mL、 1 mL、 mL、 mL、 mL 的標準液置于 100 mL 容量瓶中，同樣 用 色譜甲醇稀釋至刻度，搖 勻 ，配制成一系列濃度的鞣花酸標準品溶液 (， ， ， ， 181。g/mL)。進樣量： 20 181。Ｌ，記錄色譜峰面積，以鞣花酸 (181。g/mL)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制鞣花酸 標準曲線 [25]。 (3) 石榴皮提取液的鞣花酸含量測定 在上述的色譜條件下，吸取一定量的樣品溶液 加入 50%甲醇溶液稀釋至一定濃度，過 181。m濾膜，進 HPLC 測定。 石榴皮 游離態(tài)多酚提取液 的抗氧化活性評價 清除 DPPH 自由基能力測定 DPPH 自由基清除能力按照 ALasdvar 等 (2022)的方法進行測定 [29]，將待測樣品稀釋至 40320 ug/mL 濃度范圍內(nèi)。具體步驟為 : (1) 實驗試劑的配制 DPPH 溶液：取 gDPPH 粉末，用甲醇溶解至 50mL，得到 DPPH 溶液（ 1 mmoL/L） 。 TroLox 溶液：取 gTroLox 粉末用甲醇及蒸餾水溶解至 50 mL，得到 1 mg/mL 的 TroLox 溶液。 (2) TroLox 標準曲線的繪制 將 1 mg/mL 的 TroLox 溶液稀釋至 、 、 、 、 、 、 mg/mL，分別取 mL于 5 mL 離心管中，加入 mL 用甲醇新鮮配置的 DPPH 溶液，再加入 2 mL 甲醇，搖勻后避光靜北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 9 置 20 min，在 517 nm 波長處測吸光值，繪制標準曲線。 (3) 石榴皮提取液的清除 DPPH 自由基能力測定 將 6 個品種的石榴皮提取液分別稀釋 200 倍、 100 倍、 50 倍、 40 倍、 30 倍、 20 倍，再分別取無水甲醇、原液及不同稀釋倍數(shù)的溶液 mL 于 5 mL 離心管中，加入 mLDPPH 溶液和 2 mL甲醇，搖勻后避光靜置 20 min，以純甲醇為空白對照，在 517 nm 波長處測吸光值，重復(fù)實驗三次求平均自由基清除率。 DPPH 自由基清除率： RSA(%)=(1AS/A0)*100% 其中， RSA(%)是 DPPH 自由基清除率， A0 是 mLDPPH+ mL 甲醇在 517 nm 處的吸光值，AS 是 mLDPPH+ mL 樣品溶液 +2mL 甲醇在 517 nm 處的吸光值。 清除 ABTS 自由基能力測定 (1) 實驗試劑的配制 ABTS 儲備液：稱量 gABTS 粉末，用蒸餾水定容至 25 mL 容量瓶中，配得 7 mmoL/L 的ABTS+溶液。稱量 g 的過硫酸鉀，用蒸餾水定容至 5 mL 容量瓶中，配得 140 mmoL/L 的過硫酸鉀溶液。分別取 25 mLABTS 溶液和 過硫酸鉀溶液使之以 :1 的比例混合，室溫下避光靜置 16 h，制的 ABTS 自由基陽離子 （ ABTS+）儲備液。 ABTS+工作液：使用前將 ABTS+儲備液和無水甲醇以 1:48 的比例稀釋，得到 ABTS+工作液， 4 mL 工作液 +1 mL 無水甲醇混合后在 734 nm 波長處吸光度為 177。 時工作液合格。 (2) TroLox 標準曲線的繪制 將 1 mg/mLTroLox 溶液稀釋至 、 、 、 、 、 、 mg/mL，分別取這些不同濃度的 TroLox 溶液 mL 于 5mL 離心管中，再分別加入 mL 新鮮配置的 ABTS+工作液，混勻后避光靜置 6~10 min，最后在 734 nm 處測吸光值，繪制標準曲線。 (3) 石榴皮提取液的清除 ABTS 自由基能力測定 將 6 個品種的石榴皮提取液分別稀釋 1000 倍、 500 倍、 200 倍、 100 倍、 50 倍 ，然后取不同稀釋倍數(shù)的樣品溶液 mL 于 5mL 離心管中，加入 mL 新鮮配置的 ABTS+工作液，搖勻，靜置6~10 min，在 734 nm 波長處測吸光值。重復(fù)三次求平均 ABTS+自由基清除率。 ABTS+自由基清除率： RSA(%)=(1AS/A0)*100% 其中， RSA(%)是 ABTS+自由基清除率， A0是 mL ABTS+工作液 + mL 甲醇在 734 nm 處的吸光值， AS是 mL ABTS+工作液 + mL 樣品溶液在 734 nm 處的吸光值。 北京林業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 10 鐵氰化鉀還原力測定 （ FRAP） (1) 實驗試劑的配制 磷酸緩沖液：首先應(yīng)配制 Na2HPO4和 NaH2PO4，取 ，用蒸餾水定容至 250mL；取 ，用蒸餾水定容至 250mL。然后分別取 溶液及 溶液混合搖勻，得到 100mL 磷酸緩沖液（ 、 ）。 鐵氰化鉀 [K3Fe(CN)6]溶液：取 1g 鐵氰化鉀粉末，用蒸餾水定容至 100mL，得到 1%的鐵氰化