【文章內(nèi)容簡介】 valent catalysis）。 A?B + E： ??? A?E + B H2O A?E ??? A + E： + B 酶舉例 親核基團 共價結(jié)合中間產(chǎn)物 絲氨酸蛋白酶 絲氨酸 ?OH ?；? 巰基酶 半胱氨酸 ?SH ?；? ATP酶 天冬氨酸 ?COO? 磷酰基酶 含吡哆醛的酶 賴氨酸 ?NH2 Schiff堿 磷酸甘油酸變位酶 組氨酸 磷?；? 谷氨酰胺合成酶 酪氨酸 ?OH 腺嘌呤酶 酶的親核基團與底物共價結(jié)合 3． 親核催化 : 酶可通過親核催化或親電子催化加速反應(yīng) 酶活性中心有的催化基團屬于親核基團 ， 可以提供電子給帶有部分正電荷的過渡態(tài)底物 ， 形成瞬間 共 價 鍵 。 這 種 催 化 作 用 稱 為 親 核 催 化（ nucleophilic catalysis） 。 親電子催化 （ electrophilic catalysis） 可使酶活性中心的陽離子親電子基團與富含電子的底物形成共價鍵 。 三、酶對底物有高度的選擇性 酶的 特異性或?qū)Ｒ恍裕?specificity） 酶對其所催化的底物和反應(yīng)類型具有嚴格的選擇性，一種酶只作用于一種化合物，或一類化學(xué)鍵，催化一定的化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生一定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的現(xiàn)象。 （一）有的酶對其底物和反應(yīng)類型具有極其嚴格的選擇性 有的酶僅對一種特定結(jié)構(gòu)的底物起催化作用 ， 產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物 。 酶對底物的這種 極 其 嚴 格 的 選 擇 性 稱 為 絕 對 特 異 性（ absolute specificity） 。 脲酶僅水解尿素，對甲基尿素則無反應(yīng)。 （二）多數(shù)酶具有相對特異性 多數(shù)酶可對一類化合物或一種化學(xué)鍵起催化作用，這種對底物分子不太嚴格的選擇性稱為 相對特異性（ relative specificity）。 脂肪酶不僅水解脂肪，也可水解簡單的酯。 胰蛋白酶水解由堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵。 作用于大分子的酶的絕對和相對特異性的理解：例如核酸內(nèi)切酶 人體內(nèi)有多種蛋白激酶，它們均催化底物蛋白質(zhì) 絲氨酸（或蘇氨酸）殘基上羥基的磷酸化 蛋白激酶 共有序列 蛋白激酶 A XR(R/K)X(S/T)X 蛋白激酶 C X(R/K13,X02)(S/T)(X02,R/K13)X 蛋白激酶 G X(R/K)23X(S/T)X Ca2+/鈣調(diào)素蛋白激酶 H XRXX(S/T)X （三）有些酶僅對底物分子的某種構(gòu)型起催化作用 酶對空間構(gòu)型所具有的特異性要求稱為空間異構(gòu)特異性 （ stereospecificity） 延胡索酸酶僅對延胡索酸 (反丁烯二酸 )起催化作用 ， 將其加水生成蘋果酸 ， 對順丁烯二酸則無作用 ?旋光異構(gòu)特異性： 例如 ： L乳酸脫氫酶 丙酮酸 L乳酸 D乳酸脫氫酶 丙酮酸 D乳酸 C CH3 OH COOH H C CH3 OH COOH H L(+)乳酸 D()乳酸 酵母中的酶 D型葡萄糖 發(fā)酵 酵母中的酶 L型葡萄糖 發(fā)酵 L精氨酸酶 L精氨酸 L鳥氨酸 + 尿素 D精氨酸 ?幾何異構(gòu)特異性 延胡索酸酶 反丁烯二酸 蘋果酸 延胡索酸酶 順丁烯二酸 三、 酶的可調(diào)節(jié) 性 酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機體對不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動的需要。 如溫度、 pH、底物濃度、抑制劑、激活劑以及反應(yīng)底物和產(chǎn)物對酶活性的調(diào)節(jié)；誘導(dǎo)劑或者阻遏劑對酶含量的調(diào)節(jié)等 四、酶活性測定原則 酶活性或反應(yīng)分析都需測定酶反應(yīng)速率 （一）酶反應(yīng)速率通常用單位時間內(nèi)底物減少量或產(chǎn)物增加量來表示 酶的活性 : 以 國際單位 （ international unit, IU） 表示 。 在規(guī)定的實驗條件下 （ 如溫度 、 pH的限定和足夠的底物濃度等 ） ， 每分鐘催化 1?mol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為 1個國際單位 （ IU） 。 催量 （ Katal） 1IU＝ 10－ 9 Kat 1催量是指在特定條件下，每秒鐘將 1mol底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量 比活性 （ specific activity）：比較酶的純度 比活性單位是每 mg蛋白質(zhì)所含酶的國際單位數(shù)， 其單位是 IU mg?1。 酶活力測定方法 步驟 ： （ 1）配制底物溶液 __保證底物的純度和濃度 (5Km)，及新鮮度 （ 2）確定反應(yīng)條件 __溫度： 25℃ 、 37℃ 、最適溫度及其他 __pH：最適 pH（合適的緩沖液） __其他：適當(dāng)添加激活劑。 （ 3）反應(yīng)開始，記時間 （ 4）測定產(chǎn)物的生產(chǎn)量或底物的減少量 ? 終止反應(yīng)的方法： ? 放入沸水浴，使得酶失活 ? 加入適宜的酶的變性劑，如三氯醋酸等 ? 加入酸或堿溶液，是 pH迅速偏離最適 pH ? 將反應(yīng)液放入冰箱（ 10℃ ） ? 。 （二）有三類方法對底物和產(chǎn)物的變化量進行檢測 1． 直接測定法： 是對底物或產(chǎn)物的含量變化進行直接檢測 有些酶促反應(yīng)可在反應(yīng)進行一定時間后 ，不用任何輔助反應(yīng)便可直接測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的濃度 。 這類測定方法稱為 直接測定法（ direct assay） 。 還原型 （ Fe2+） 細胞色素 c在波長 550nm處有明顯的吸收峰 ， 而氧化型 （ Fe3+） 則無；細胞色素 c氧化酶對細胞色素 c的氧化反應(yīng) ， 可以直接在波長 550nm處檢測一定時間內(nèi)還原型細胞色素 c的減少過程 。 還原型 cytC 氧化型 cytC （ Fe2+） （ Fe3+） λ550下降 有些酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物不能直接進行檢測 ，必須增加一些輔助試劑來達到檢測的目的 ， 這種方法稱為 間接測定法 （ indirect assay） 2． 間接測定法： 利用非酶輔助反應(yīng)對底物或產(chǎn)物的變化進行間接檢測 二氫乳清酸脫氫酶 二氫乳清酸 + 泛醌 ?????? 乳清酸 + 泛醇 泛醇 + 2,6二氯酚靛酚（氧化型） ??? 泛醌 + 2,6二氯酚靛酚（還原型） （亮藍色，在 610nm處有吸收峰） （在 610nm處無吸收峰） 3． 偶聯(lián)測定法： 不直接涉及原始反應(yīng)的底物或產(chǎn)物 許多酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物雖然不能直接檢測 ，但可以與另外的酶反應(yīng)相偶聯(lián) ， 偶聯(lián)的酶以第一個酶的產(chǎn)物為底物 ， 或以此類推 ， 以最后的酶反應(yīng)產(chǎn)物可以直接檢測為目的 。 這種通過偶聯(lián)其他酶并對此酶促產(chǎn)物進行直接檢測 ， 間接地反映待測酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物變化量的方法稱為 酶偶聯(lián)測定法（ enzyme coupled assay） 外加的酶稱為 工具酶或輔助酶 （ auxiliary enzyme） 產(chǎn)物可直接檢測的酶稱為 指示酶 （ indicator enzyme） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 + ?酮戊二酸 ????? 丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脫氫酶 丙酮酸 + NADH + H+ ????? 乳酸 + NAD+ （在 340nm處有吸收峰） （在 340nm處無吸收峰） （三）酶聯(lián)免疫分析測定蛋白質(zhì)是酶分析的發(fā)展 酶聯(lián)免疫分析 又稱 酶聯(lián)免疫吸附測定 （ enzymelinked immunosorbent assays, ELISA） 是利用酶的快速、靈敏、可定量檢測的優(yōu)點和免疫學(xué)方法中抗原 抗體特異性結(jié)合的優(yōu)點，將指示酶與抗體偶連，對抗原進行檢測的一種方法 。 常用的方法 將辣根過氧化物酶與抗體偶聯(lián)，通過顯色測定酶的活性，進而計算出與酶偶聯(lián)抗體所結(jié)合的抗原的量。 五、酶促反應(yīng)動力學(xué) 一、采用酶促反應(yīng)初速率來研究酶促反應(yīng)動力學(xué) ?概念 研究各種因素對 酶促反應(yīng)速率 的影響，并加以定量的闡述。 ?影響因素包括有 酶濃度、底物濃度、 pH、溫度、抑制劑、激活劑等。 ※ 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。 I. 單底物 、 單產(chǎn)物反應(yīng)； 反應(yīng)速率 （ velocity， V） 一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下 ， 用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示 ； ， 即底物的消