【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。 ：上述談到的抗原或半抗原物質(zhì)，防止在組織或細(xì)胞內(nèi)丟失是非常重要的。在組織處理過(guò)程中，如固定、包埋、薄切、反應(yīng)，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定液及包埋方法要十分注意。 ：抗體是機(jī)體受抗原刺激后，由 B淋巴細(xì)胞、特別是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的一種球蛋白，即免疫球蛋白（ Immunoglobulin,Ig)，共有五類： IgG, IgA, IgM, IgD, 和 IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以 IgG為主，約占 70~80％。 1〕 抗體的制備方法： A 多克隆抗體 （血清抗體 〕 ：指機(jī)體接受抗原主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后從血清中分離提純的抗體。 B 單克隆抗體 ：是 1975年由 Kohlenh Milstein發(fā)明的一種新技術(shù)。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞既有骨髓細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細(xì)胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（ monoclonal antibody,McAb) 2) 單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類抗體的混合物 單一種類的抗體 特異性 低針對(duì)多個(gè)抗原決定族 高針對(duì)單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應(yīng) 高 低 4． 抗原與抗體的特異性結(jié)合 抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)中有 3個(gè)特殊的易變部位，即在第 30位、 50一 60位和第 100位氨基酸殘基附近，這些部位稱為超變區(qū)。超變區(qū)直接參與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個(gè)淺平穴槽，槽大小約 入槽內(nèi)，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而相互結(jié)合?？乖c抗體分子的結(jié)合不受兩者數(shù)量比例的限制，但如要出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)， 則抗原與抗體的量需有一定的適當(dāng)?shù)谋壤駝t在抗原與抗體過(guò)量的情況下，不能聚合成大顆粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)。 三 ． 免疫組織化學(xué)的基本技術(shù) （ 一 〕 取材 1． 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：麻醉 （ 處死 〕 ， 鋒利刀片切成大小適中 ， 厚度 3mm～ 4mm。 小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：灌注 （ 流 ） 固定 （ 生理鹽水和 4％ 多聚甲醛 〕 取材 2． 人體材料：活檢組織 、 手術(shù)標(biāo)本 、 細(xì)胞和組織 （ 二 ） 固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測(cè)抗原的前提下 ，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時(shí)間 ， 固定時(shí)間一般為1~12h。 1． 常用的固定劑： 1） 甲醛緩沖液：廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定 ， 甲醛在很好地保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)也有效地保存某些抗原 。 由于甲醛的交聯(lián)作用會(huì)影響被固定細(xì)胞膜的通透性不利于染色時(shí)抗體的滲透 ， 因此染色前常用酶進(jìn)行消化以使抗原決定簇充分暴露 ，固定時(shí)間不直超過(guò) 24h。 2） 4％ 多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究 。 3） 戊二醛 ~多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡 、 電鏡免疫組織化學(xué)研究 。 4） 其它：如 PLP液 （ 過(guò)碘酸 ~賴 AA~多聚甲醛固定液 ） 、 丙酮及醇類 、 鋨酸等 。 2． 固定注意事項(xiàng)： 1） 固定液的選擇標(biāo)準(zhǔn)： A. 組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好； B. 最大限度 保存抗 原的抗原性 。 中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用最廣的固定劑 。 2） 組織塊的大?。? 。 3） 固定時(shí)間：與組織塊大小成正比 ， 與固定液濃度成 反比 。 4） 溫度：一般在室溫下進(jìn)行 ， 電鏡標(biāo)本和固定時(shí)間較長(zhǎng)時(shí) 可放置在 4℃ 冰箱 。 5〕 固定后處理：充分沖洗 ， 除去多余固定劑 。 （ 三 ） 包埋： ； ； 。 （ 四 ） 切片： ： 1） 清洗 ； 2） 涂膠 （ 防止脫片 ） 常用粘附劑： ① 明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠； ② 樹(shù)脂膠： 也稱白膠； ③ 多聚賴氨酸 （ PLL） ； ④ 商品化粘附劑 。 ： l） 石蠟切片：厚約 3～ 5 181。m 放置 37 ℃ 溫箱烘烤過(guò)夜 ， 以減少脫片 。 2） 冷凍切片： 2 181。m 。 3） 振動(dòng)切片：特點(diǎn)是組織經(jīng)固定后不需包埋 ， 只要用膠水粘在 載物臺(tái)上即可切片 。 切片較厚 ， 可將陽(yáng)性部位作電鏡包埋 。 神經(jīng)組織應(yīng)用 較多 。 四 ． 免疫組化染色過(guò)程中的基本技術(shù) （ 一 ） 蛋白酶消化技術(shù) 進(jìn)行固定時(shí) ， 抗原決定簇有可能被固定劑所封閉 ， 因此在抗原抗體反應(yīng)前 ， 常用蛋白酶處理組織切片 ， 使抗原決定簇充分暴露出來(lái) ， 并使組織的通透性增高 ， 以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)特異性染色 。 1． 常用的消化酶：胰蛋白酶 、 胃蛋白酶 2． 消化時(shí)間：因組織而異 ， 一般為 5~30分鐘 ， 消化時(shí)間不宜太長(zhǎng) ， 以免損傷組織形態(tài) ， 破壞抗原決定族 。 消化結(jié)束后要充分洗滌 ， 以除去殘留的蛋白酶 。 1） 非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過(guò)程中凡不屬于特異性抗原抗體反應(yīng)所出現(xiàn)的染色 。 1． 原因分析： 組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光 、 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶或堿 性磷酸酶 、 內(nèi)源性生物素等； 試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過(guò)量等。 2． 消除方法： A. 加 1抗前加正常血清 10~30分 ， 以封閉組織中帶電荷的基 因 ， 避免與 1抗的非特異性結(jié)合 。 B . 減少非特異性染色： a 免疫酶組化染色時(shí) ， 在加 1抗前 ， 用 ％ 的 H2O2甲醇溶 液將組織切片處理 30分 （ 若是 3％ 的 H2O2甲醇溶液處 理 5~10分 ） 。 b 免疫熒光染色時(shí) ， 可用 ~％ 伊文思藍(lán)稀釋熒光 抗 體 。 （ 二 ） 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照片：用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本作對(duì)照 。 陰性對(duì)照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對(duì)照 。 （ 三 ） 抗體的分裝 、 稀釋 、 滴加及保存 1． 抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的 EP管內(nèi) ， 保存在 20 ～ 40 ℃ 的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效 。 2． 抗體稀釋：常用 PBS（ 磷酸緩沖溶液 ） 或 BSA （ 牛血清白蛋白 ） 3． 滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片 ， 一般加 30～ 50181。l ，最好在滴加前 ， 用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫(huà)一圈 ， 以防溶液的擴(kuò)散 。 4． 保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存 ， 已稀釋未 用完的抗體最好在一周內(nèi)用完 ， 不宜長(zhǎng)期保存 。 （ 四 ） 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù) 1． 免疫酶染色原理： 用酶作為標(biāo)記物 ， 可分為直接法 、 間接法 、 補(bǔ)體法 、 免疫 酶橋法 、 免疫酶雙橋法 、 過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 （ PAP法 ） 和雙 PAP法等 。 1） 直接法原理：用酶直接標(biāo)記在特異性 1抗上 ， 與標(biāo)本中的 抗原結(jié)合 ， 讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物 ， 沉淀在抗原 抗體反應(yīng)部位 ， 即可在鏡下對(duì)標(biāo)本的抗原進(jìn)行檢測(cè) 。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)；缺點(diǎn)：敏感性差。 2） 間接法原理：先用標(biāo)記的特異性 1抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié) 合 ， 再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體 （ 2抗 ） 孵育 ， 然后再加 酶的底物 ， 顯示抗原～抗體～抗原抗體復(fù)合物存在的部 位 ， 以對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè) 。 如： 1抗是由免產(chǎn)生的多克隆抗體： 則 2抗常用羊抗兔 IgG； 如： 1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體： 則 2抗常用羊或馬抗鼠 IgG。 以上兩種方法稱為酶標(biāo)抗體法 3） 非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動(dòng)物 ， 產(chǎn)生抗酶的抗體 。 通過(guò)酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記 。 該方法適用于石蠟包埋的組織切片 。 原理：首先用酶作為抗原免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后以 2抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的lffo抗酶抗體連接