【文章內容簡介】 酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應的特異性抗體進行檢測。 ：上述談到的抗原或半抗原物質，防止在組織或細胞內丟失是非常重要的。在組織處理過程中，如固定、包埋、薄切、反應，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定液及包埋方法要十分注意。 ：抗體是機體受抗原刺激后，由 B淋巴細胞、特別是漿細胞分泌產生的一種與相應抗原發(fā)生反應的一種球蛋白，即免疫球蛋白（ Immunoglobulin,Ig)，共有五類： IgG, IgA, IgM, IgD, 和 IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以 IgG為主，約占 70~80％。 1〕 抗體的制備方法： A 多克隆抗體 （血清抗體 〕 ：指機體接受抗原主動免疫或被動免疫后從血清中分離提純的抗體。 B 單克隆抗體 ：是 1975年由 Kohlenh Milstein發(fā)明的一種新技術。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細胞和免疫的脾細胞相融合，產生雜交細胞。這種融合的雜交細胞既有骨髓細胞的無限生長能力，又有漿細胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細胞純化，成為單克隆系，就能產生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（ monoclonal antibody,McAb) 2) 單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類抗體的混合物 單一種類的抗體 特異性 低針對多個抗原決定族 高針對單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應 高 低 4． 抗原與抗體的特異性結合 抗原與抗體的結合具有高度的特異性。在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)中有 3個特殊的易變部位，即在第 30位、 50一 60位和第 100位氨基酸殘基附近，這些部位稱為超變區(qū)。超變區(qū)直接參與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個淺平穴槽，槽大小約 入槽內，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而相互結合?？乖c抗體分子的結合不受兩者數量比例的限制，但如要出現(xiàn)肉眼可見的反應， 則抗原與抗體的量需有一定的適當的比例，否則在抗原與抗體過量的情況下，不能聚合成大顆粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見的反應。 三 ． 免疫組織化學的基本技術 （ 一 〕 取材 1． 實驗動物：麻醉 （ 處死 〕 ， 鋒利刀片切成大小適中 ， 厚度 3mm～ 4mm。 小型實驗動物：灌注 （ 流 ） 固定 （ 生理鹽水和 4％ 多聚甲醛 〕 取材 2． 人體材料：活檢組織 、 手術標本 、 細胞和組織 （ 二 ） 固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下 ，應采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間 ， 固定時間一般為1~12h。 1． 常用的固定劑： 1） 甲醛緩沖液：廣泛應用于病理標本的固定 ， 甲醛在很好地保護組織形態(tài)結構完整的同時也有效地保存某些抗原 。 由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細胞膜的通透性不利于染色時抗體的滲透 ， 因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露 ，固定時間不直超過 24h。 2） 4％ 多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應用于光鏡細胞化學研究 。 3） 戊二醛 ~多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡 、 電鏡免疫組織化學研究 。 4） 其它：如 PLP液 （ 過碘酸 ~賴 AA~多聚甲醛固定液 ） 、 丙酮及醇類 、 鋨酸等 。 2． 固定注意事項： 1） 固定液的選擇標準： A. 組織形態(tài)結構保存良好； B. 最大限度 保存抗 原的抗原性 。 中性甲醛和多聚甲醛是應用最廣的固定劑 。 2） 組織塊的大?。? 。 3） 固定時間：與組織塊大小成正比 ， 與固定液濃度成 反比 。 4） 溫度：一般在室溫下進行 ， 電鏡標本和固定時間較長時 可放置在 4℃ 冰箱 。 5〕 固定后處理：充分沖洗 ， 除去多余固定劑 。 （ 三 ） 包埋： ； ； 。 （ 四 ） 切片： ： 1） 清洗 ； 2） 涂膠 （ 防止脫片 ） 常用粘附劑： ① 明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠； ② 樹脂膠： 也稱白膠； ③ 多聚賴氨酸 （ PLL） ； ④ 商品化粘附劑 。 ： l） 石蠟切片：厚約 3～ 5 181。m 放置 37 ℃ 溫箱烘烤過夜 ， 以減少脫片 。 2） 冷凍切片： 2 181。m 。 3） 振動切片：特點是組織經固定后不需包埋 ， 只要用膠水粘在 載物臺上即可切片 。 切片較厚 ， 可將陽性部位作電鏡包埋 。 神經組織應用 較多 。 四 ． 免疫組化染色過程中的基本技術 （ 一 ） 蛋白酶消化技術 進行固定時 ， 抗原決定簇有可能被固定劑所封閉 ， 因此在抗原抗體反應前 ， 常用蛋白酶處理組織切片 ， 使抗原決定簇充分暴露出來 ， 并使組織的通透性增高 ， 以利抗原抗體最大限度地結合增強特異性染色 。 1． 常用的消化酶：胰蛋白酶 、 胃蛋白酶 2． 消化時間：因組織而異 ， 一般為 5~30分鐘 ， 消化時間不宜太長 ， 以免損傷組織形態(tài) ， 破壞抗原決定族 。 消化結束后要充分洗滌 ， 以除去殘留的蛋白酶 。 1） 非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反應所出現(xiàn)的染色 。 1． 原因分析： 組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光 、 內源性過氧化物酶或堿 性磷酸酶 、 內源性生物素等； 試劑方面：因抗體不純、標記的酶和熒光不純或標記過量等。 2． 消除方法： A. 加 1抗前加正常血清 10~30分 ， 以封閉組織中帶電荷的基 因 ， 避免與 1抗的非特異性結合 。 B . 減少非特異性染色： a 免疫酶組化染色時 ， 在加 1抗前 ， 用 ％ 的 H2O2甲醇溶 液將組織切片處理 30分 （ 若是 3％ 的 H2O2甲醇溶液處 理 5~10分 ） 。 b 免疫熒光染色時 ， 可用 ~％ 伊文思藍稀釋熒光 抗 體 。 （ 二 ） 對照實驗 陽性對照片：用已知抗原為陽性的標本作對照 。 陰性對照片：確認不含己知抗原的標本作對照 。 （ 三 ） 抗體的分裝 、 稀釋 、 滴加及保存 1． 抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的 EP管內 ， 保存在 20 ～ 40 ℃ 的低溫冰箱中持用可保持數年有效 。 2． 抗體稀釋：常用 PBS（ 磷酸緩沖溶液 ） 或 BSA （ 牛血清白蛋白 ） 3． 滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片 ， 一般加 30～ 50181。l ，最好在滴加前 ， 用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈 ， 以防溶液的擴散 。 4． 保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存 ， 已稀釋未 用完的抗體最好在一周內用完 ， 不宜長期保存 。 （ 四 ） 免疫酶組織化學技術和酶標抗體技術 1． 免疫酶染色原理： 用酶作為標記物 ， 可分為直接法 、 間接法 、 補體法 、 免疫 酶橋法 、 免疫酶雙橋法 、 過氧化物酶抗過氧化物酶法 （ PAP法 ） 和雙 PAP法等 。 1） 直接法原理：用酶直接標記在特異性 1抗上 ， 與標本中的 抗原結合 ， 讓酶催化底物反應產生有色產物 ， 沉淀在抗原 抗體反應部位 ， 即可在鏡下對標本的抗原進行檢測 。 優(yōu)點：簡便、快速、特異性強；缺點：敏感性差。 2） 間接法原理：先用標記的特異性 1抗與標本中相應抗原結 合 ， 再用酶標記的抗球蛋白抗體 （ 2抗 ） 孵育 ， 然后再加 酶的底物 ， 顯示抗原～抗體～抗原抗體復合物存在的部 位 ， 以對抗原進行檢測 。 如： 1抗是由免產生的多克隆抗體： 則 2抗常用羊抗兔 IgG； 如： 1抗是由鼠產生的單克隆抗體： 則 2抗常用羊或馬抗鼠 IgG。 以上兩種方法稱為酶標抗體法 3） 非酶標記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物 ， 產生抗酶的抗體 。 通過酶與抗體的特異性結合進行標記 。 該方法適用于石蠟包埋的組織切片 。 原理：首先用酶作為抗原免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后以 2抗為橋梁，將在組織中與抗原結合的lffo抗酶抗體連接