【正文】 則 2抗常用羊或馬抗鼠 IgG。 通過酶與抗體的特異性結(jié)合進行標記 。 原理：首先用酶作為抗原免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后以 2抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的lffo抗酶抗體連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)呈色反應(yīng)顯示抗原的分布。不但提高了敏感性，同時還節(jié)省了 1抗的用量。 （酶標識特異抗體 〕 （酶標識二次抗體 〕 生物素 HRP ALP 1． 常用的酶種類： 常用的酶大多為辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase, HRP） 介紹幾種酶的底物及產(chǎn)生沉淀的顏色 。 2） 濕潤盒：放置抗原抗體反應(yīng)過程中反應(yīng) ， 避免干燥 。l、 20～ 200 181。l必備 。 1〕 緩沖液： PBS, M 磷酸緩沖液 （ ） TBS, M Tris鹽酸緩沖液 （ ） 2〕 抗體稀釋液 : 1％ BSA或 M PBS 3〕 10％ 2抗免疫動物的正常血清 4〕 DBA－ H2O2顯色液 5〕 核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠 （ 二 〕 sABC法的操作過程 1. 基本原理： sABC（ streptoavidinbiotin peroxidase plex）鏈球菌～抗生物素（卵白蛋）～生物素～過氧化物酶復(fù)合物 生物素 （ biotin） ：是一種分子量為 244da的小分子的維生素 。 生物素與抗生物素有很強的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。所以生物素 抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優(yōu)點。 要滿足這些條件 ， 取材 、 固定 、 切片厚度 、 操作過程 、 抗體濃度及特異性的選擇 、 操作前蛋白酶的消化 、 抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生 。 2． 切片：切片不宜過厚 ， 一般 4181。 切片不宜過大 ， 載玻片要涂粘附劑 ， 以防脫片 。 3． 脫蠟：脫蠟一定要徹底 ， 新鮮二甲苯 5min 3。一般用 % 胰蛋白酶或胃蛋白酶消化 5～ 30min。 6． 抗體的選擇：選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于 石蠟切片的抗體 ， 或是二者均可；其次要看抗體說明 ， 是 單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物 ， 由此來選擇 2抗；還有抗體的稀度 （ 在實驗前根據(jù)預(yù)實驗 選擇最佳濃度 〕 。 8． DAB— H2O2顯色：注意 H2O2的濃度 ， 必須在顯示前加入 H2O2均勻攪拌 ， 最佳顯色時間在 3～ 5min， 過短或過長都 不會出現(xiàn)滿意的效果 。 10． 結(jié)果判定：以下用圖片說明 。2 表達，主要在近曲腎小管內(nèi)， sABC法 IgAN, TGF223。 ： 鑒定反應(yīng)性增生疾病與淋巴瘤； 各種淋巴瘤的分型。從細胞超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原抗體的免疫反應(yīng)，必須使抗體帶上具有高電子密度的標記物，這樣才能在電鏡下觀察反應(yīng)分結(jié)果。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。 根據(jù)抗體特異性結(jié)合的原理，在亞細胞水平定性定位。在對細胞內(nèi)抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標記同一細胞內(nèi)不同的抗原。 三、免疫電鏡的基本技術(shù)方法 (1)取材 :各種培養(yǎng)細胞和分離的血細胞應(yīng)隨用隨?。挥坞x的培 養(yǎng)細胞可先進行離心；貼壁細胞可在載玻片上固定， 也可用胰蛋白酶將細胞消化下來；取組織塊時應(yīng)做到 越快越好，最好在沒有停止血流前取材。 （ PG固定液） ～賴氨酸～多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液） ～多聚甲醛～戊二醛固定液（ PAPG固定液 ) 固定方法與時間： （最好方法） （ 1）包埋前免疫電鏡技術(shù) 是指先對標本進行免疫標記，然后進行包埋、切片、觀察。 詳見 包埋前和包埋后電鏡技術(shù)的比較 包埋前與包埋后的比較 包埋前 包埋后 優(yōu)點 缺點 修正 未經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，標記的陽性率高，提高電鏡的檢出率。 標記前細胞內(nèi)抗原受到標記抗體的穿透性限制（因是組織塊） 制作厚切片；增加細胞膜的通透性 具有陽性結(jié)果重復(fù)性高、方法簡便可靠的優(yōu)點，可對同一組織塊的連續(xù)切片作各種對照染色，能十分準確的解釋染色結(jié)果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫染色。 細胞膜保存差（鋨酸作用） 固定液選擇苦味酸 (保護細胞膜 ) 包埋劑協(xié)作低溫樹脂 肝細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，可見 G6P酶陽性反應(yīng)產(chǎn)物。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽性反應(yīng)顆粒（ 36000） IgAN, TGFs2的表達，免疫金銀法 IgAN, TGFs2的表達，免疫金銀法 K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機聯(lián)合的免疫電鏡法 （實驗結(jié)果介紹） 免疫電鏡技術(shù)是從超微結(jié)構(gòu)水平能顯示抗原和抗體結(jié)合后在細胞微細結(jié)構(gòu)水平的定位，這一技術(shù)已成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項重要研究手段。本研究組選用了 Lowicryls K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機（ SPI17020），對免疫電鏡觀察的標本進行了處理，目的是更好的保存被檢測組織中抗原的活性，提高檢出率。 一、 紫外線低溫包埋機（ SPI17020） SPI17020是美國特殊研制的低溫包埋機，它最主要的特點是采用數(shù)字化溫度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在 10℃ ～ 37℃ 之間。它占地面范圍小，但機內(nèi)空間較大，可以同時放入 72個包埋膠囊。 總之，紫外線低溫包埋機是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機器。 三、方法 商品提供的 Lowicrys K4M包埋劑由三個部分組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。中等硬度的組織塊，其配制比例如下： （ 1） Lowicryls K4M：單體 ；交聯(lián)劑 ；引發(fā)劑。勿過分攪拌，以防空氣的氣泡進入包埋劑中。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。 、固定、處理 （ 1）組織的取材與固定：用銳刀將新鮮組織切成 1～3mm3的小塊 , 迅速置于 3%多聚甲醛 1%戊二醛固定液中 , 2～ 3h。 （ 3）組織或細胞處理過程 將固定好的標本用 , 10min 3次；用 （ ）封閉游離的醛基 30min； ； 4℃ 30%,50%乙醇脫水 30min； 20℃ 乙醇系列逐級脫水至 100%，各 1h（乙醇溶液應(yīng)先在冰箱中預(yù)冷）。標本放入含包埋劑的膠囊加蓋后放入紫外線低溫包埋機中， 20℃ 下用紫外線燈照射 24h；室溫紫外線燈繼續(xù)照射 3～ 4天，使樣品完全聚合固化。 免疫標記的切片用 3%的 H2O2 室溫下處理 6～ 10min后，用 3次。再次用 液漂洗和 1%BSAPBS封閉后用 5nm膠體金 IgG探針標記 60min，最后經(jīng)緩沖液沖洗，每次 10min。標記后的切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛各染色 10min ,用 JEM122O透射電鏡下觀察。對細胞進行免疫標記，待檢測的物質(zhì)位于細胞內(nèi)時，最好采用 10nm膠體金進行精細定位。 四、結(jié)果 五、討論 免疫電鏡技術(shù)面臨微細結(jié)構(gòu)的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾，本研究采用低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機的方法緩解了這一對矛盾的發(fā)生。采用的低濃度的戊二醛和多聚甲醛固定液既保存了抗原活性又有利于微細結(jié)構(gòu)的觀察。 Lowicryls K4M低溫包埋劑具有親水性，可以在紫外線低溫包埋機中進行低溫聚合，它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，并可減少非特異的抗體吸附。 總之，免疫電鏡技術(shù)在科學(xué)研究和對疾病組織內(nèi)特殊物質(zhì)表達位置的鑒定以及量的多少具有著廣闊的發(fā)展前景。使用低溫包埋劑是免疫細胞化學(xué)方法成功的關(guān)鍵之一，紫外線低溫包埋機可以自動控制溫度，機箱內(nèi)可容納大量的包埋塊，并且紫外線能充分均勻的照射組織塊，使包埋塊硬度均勻，利于切片。 附：免疫金標記技術(shù)的應(yīng)用范圍 （ 1）免疫金標記技術(shù)是金探針作為抗體與組織和細胞內(nèi)抗原發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)，使金顆粒附著在反應(yīng)部位，定位準確，金顆粒電子密度很高， EM下清晰可辨。根據(jù)實驗要求可選擇大小直徑不同的膠體金顆粒（如 3nm， 5nm， 10nm …… ） （ 3）在超微結(jié)構(gòu)水平上觀察研究細胞表面和細胞器中的特異抗原和抗體等物質(zhì)。 （ 4）金標探針可以加入到培養(yǎng)液中，對培養(yǎng)細胞抗原進行標記定位。 （ 6）可用于 SEM和 X線衍射分析。 （ 8）可用于標記石臘切片和半薄切片。