【正文】 或黑藍色，胞核黑色，膠原纖維呈紅色 Verhoeff鐵蘇木素染色法 Lendrum纖維素染色法 顯示腎小球毛細血管腔內血栓形成 第四章： 免疫組織化學（ Immunohistochemistry） 一 ． 定義： 應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位、或定量研究，這種技術稱免疫組織化學（ immunohistochemistry） 或免疫細胞化學（ immunocytochemistry），簡稱免疫組化。 3． 根據(jù)標記物區(qū)分：免疫熒光法 、 放射免疫法 、 酶標法和 免疫金銀法 。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應的特異性抗體進行檢測。 1〕 抗體的制備方法： A 多克隆抗體 （血清抗體 〕 ：指機體接受抗原主動免疫或被動免疫后從血清中分離提純的抗體。將該免疫細胞純化，成為單克隆系，就能產生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（ monoclonal antibody,McAb) 2) 單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類抗體的混合物 單一種類的抗體 特異性 低針對多個抗原決定族 高針對單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應 高 低 4． 抗原與抗體的特異性結合 抗原與抗體的結合具有高度的特異性。 三 ． 免疫組織化學的基本技術 （ 一 〕 取材 1． 實驗動物：麻醉 （ 處死 〕 ， 鋒利刀片切成大小適中 ， 厚度 3mm～ 4mm。 2） 4％ 多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應用于光鏡細胞化學研究 。 中性甲醛和多聚甲醛是應用最廣的固定劑 。 5〕 固定后處理：充分沖洗 ， 除去多余固定劑 。m 放置 37 ℃ 溫箱烘烤過夜 ， 以減少脫片 。 切片較厚 ， 可將陽性部位作電鏡包埋 。 消化結束后要充分洗滌 ， 以除去殘留的蛋白酶 。 B . 減少非特異性染色： a 免疫酶組化染色時 ， 在加 1抗前 ， 用 ％ 的 H2O2甲醇溶 液將組織切片處理 30分 （ 若是 3％ 的 H2O2甲醇溶液處 理 5~10分 ） 。 （ 三 ） 抗體的分裝 、 稀釋 、 滴加及保存 1． 抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的 EP管內 ， 保存在 20 ～ 40 ℃ 的低溫冰箱中持用可保持數(shù)年有效 。 （ 四 ） 免疫酶組織化學技術和酶標抗體技術 1． 免疫酶染色原理： 用酶作為標記物 ， 可分為直接法 、 間接法 、 補體法 、 免疫 酶橋法 、 免疫酶雙橋法 、 過氧化物酶抗過氧化物酶法 （ PAP法 ） 和雙 PAP法等 。 如： 1抗是由免產生的多克隆抗體： 則 2抗常用羊抗兔 IgG； 如： 1抗是由鼠產生的單克隆抗體： 則 2抗常用羊或馬抗鼠 IgG。 原理：首先用酶作為抗原免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后以 2抗為橋梁，將在組織中與抗原結合的lffo抗酶抗體連接起來，再將酶結合在抗酶抗體上，經呈色反應顯示抗原的分布。 （酶標識特異抗體 〕 （酶標識二次抗體 〕 生物素 HRP ALP 1． 常用的酶種類： 常用的酶大多為辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase, HRP） 介紹幾種酶的底物及產生沉淀的顏色 。l、 20～ 200 181。 1〕 緩沖液： PBS, M 磷酸緩沖液 （ ） TBS, M Tris鹽酸緩沖液 （ ） 2〕 抗體稀釋液 : 1％ BSA或 M PBS 3〕 10％ 2抗免疫動物的正常血清 4〕 DBA－ H2O2顯色液 5〕 核復染液：蘇木素或甲基綠 （ 二 〕 sABC法的操作過程 1. 基本原理： sABC（ streptoavidinbiotin peroxidase plex）鏈球菌～抗生物素（卵白蛋）～生物素～過氧化物酶復合物 生物素 （ biotin） ：是一種分子量為 244da的小分子的維生素 。所以生物素 抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優(yōu)點。 2． 切片：切片不宜過厚 ， 一般 4181。 3． 脫蠟：脫蠟一定要徹底 ， 新鮮二甲苯 5min 3。 6． 抗體的選擇：選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于 石蠟切片的抗體 ， 或是二者均可；其次要看抗體說明 ， 是 單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物 ， 由此來選擇 2抗；還有抗體的稀度 （ 在實驗前根據(jù)預實驗 選擇最佳濃度 〕 。 10． 結果判定：以下用圖片說明 。 ： 鑒定反應性增生疾病與淋巴瘤； 各種淋巴瘤的分型。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。在對細胞內抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標記同一細胞內不同的抗原。 （ PG固定液） ～賴氨酸～多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液） ～多聚甲醛～戊二醛固定液（ PAPG固定液 ) 固定方法與時間： （最好方法） （ 1）包埋前免疫電鏡技術 是指先對標本進行免疫標記，然后進行包埋、切片、觀察。 標記前細胞內抗原受到標記抗體的穿透性限制（因是組織塊） 制作厚切片；增加細胞膜的通透性 具有陽性結果重復性高、方法簡便可靠的優(yōu)點，可對同一組織塊的連續(xù)切片作各種對照染色，能十分準確的解釋染色結果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫染色。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內膜基質側呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽性反應顆粒（ 36000） IgAN, TGFs2的表達，免疫金銀法 IgAN, TGFs2的表達，免疫金銀法 K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機聯(lián)合的免疫電鏡法 （實驗結果介紹） 免疫電鏡技術是從超微結構水平能顯示抗原和抗體結合后在細胞微細結構水平的定位，這一技術已成為目前生物醫(yī)學領域的一項重要研究手段。 一、 紫外線低溫包埋機（ SPI17020） SPI17020是美國特殊研制的低溫包埋機，它最主要的特點是采用數(shù)字化溫度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在 10℃ ～ 37℃ 之間。 總之，紫外線低溫包埋機是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機器。中等硬度的組織塊，其配制比例如下： （ 1） Lowicryls K4M：單體 ；交聯(lián)劑 ；引發(fā)劑。在通風櫥內操作，以免蒸氣刺激眼睛。 （ 3）組織或細胞處理過程 將固定好的標本用 , 10min 3次；用 （ ）封閉游離的醛基 30min； ； 4℃ 30%,50%乙醇脫水 30min； 20℃ 乙醇系列逐級脫水至 100%，各 1h（乙醇溶液應先在冰箱中預冷）。 免疫標記的切片用 3%的 H2O2 室溫下處理 6～ 10min后，用 3次。標記后的切片經醋酸鈾和檸檬酸鉛各染色 10min ,用 JEM122O透射電鏡下觀察。 四、結果 五、討論 免疫電鏡技術面臨微細結構的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾，本研究采用低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機的方法緩解了這一對矛盾的發(fā)生。 Lowicryls K4M低溫包埋劑具有親水性，可以在紫外線低溫包埋機中進行低溫聚合，它能較好地保持組織結構和抗原性，并可減少非特異的抗體吸附。使用低溫包埋劑是免疫細胞化學方法成功的關鍵之一，紫外線低溫包埋機可以自動控制溫度，機箱內可容納大量的包埋塊，并且紫外線能充分均勻的照射組織塊，使包埋塊硬度均勻，利于切片。根據(jù)實驗要求可選擇大小直徑不同的膠體金顆粒（如 3nm， 5nm， 10nm …… ） （ 3）在超微結構水平上觀察研究細胞表面和細胞器中的特異抗原和抗體等物質。 （ 6）可用于 SEM和 X線衍射分析。