【正文】 ，蒸餾水洗 2次； （ 2〕 浸入 1％亞硫酸鈉水溶液除掉鉻酸 1分鐘，流水洗 5分鐘，蒸餾水洗 3次； （ 3〕 浸入六胺銀硼砂液染色 1－ （ 40－ 50℃ 溫箱內(nèi) 〕 ，至切片呈淺棕色，蒸餾水 3次； （ 4〕 用 %氯化金水溶液調(diào)色 3分鐘，蒸餾水稍洗； （ 5〕 核固紅染色細(xì)胞核 10分鐘，流水洗，蒸餾水洗； （ 6〕 亮綠染色液 30秒，用蒸餾水快速稍洗； （ 7〕 無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 念珠菌（假菌絲） 新生隱球菌性腦膜炎 4. 淀粉樣物質(zhì)染色（介紹剛果紅染色） 淀粉樣物質(zhì)是一種嗜伊紅性物質(zhì)，性質(zhì)屬于糖蛋白成分。 1〕 試劑配制： （ 1〕 剛果紅染色液。 2〕 染色步驟： （ 1〕 蘇木素染色液浸染 2分鐘； （ 2〕 %鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘； （ 3〕 流水洗，蒸餾水洗 2次； （ 4〕 剛果紅染色液中 25分鐘； （ 5〕 無(wú)水乙醇迅速脫水 2次； （ 6〕 二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 剛果紅染色 5. Mallory三色染色法（屬于結(jié)締組織復(fù)合染色法 〕 1〕 試劑配制： （ 1〕 重鉻酸鉀液。苯胺藍(lán) ，橘黃 2g，磷鎢酸 1g，蒸餾水 100ml； （ 3〕 酸性復(fù)紅液。 2〕 染色步驟： （ 1〕 重鉻酸鉀液 10分鐘； （ 2〕 流水洗 2分鐘，蒸餾水洗 2次； （ 3〕 酸性復(fù)紅液 2分鐘，蒸餾水稍洗； （ 4〕 苯胺藍(lán)液 20分鐘， 95％乙醇快速分化； （ 5〕 直接用無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 特點(diǎn)：利用酸性復(fù)紅、苯胺藍(lán)、橘黃 G這三種染料對(duì)結(jié)締組織和非結(jié)締組織進(jìn)行著色。堿性復(fù)紅 1g，麗春紅 2g，橘黃 G2g，%醋酸 300ml； （ 2）亮綠染色液。 2〕 染色步驟 （ 1〕 Masson復(fù)合染色液 5分鐘； （ 2〕 %醋酸水溶液稍洗； （ 3〕 5％磷鎢酸 5－ 10分鐘； （ 4〕 %醋酸水溶液浸洗 2次； （ 5〕 亮綠染色液 5分鐘； （ 6〕 %醋酸水洗 2次； （ 7〕 無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 適用于腦垂體、上皮、甲狀腺、神經(jīng)的正常和腫瘤組織 Masson 腎小球 左： HE染色 右： Masson染色，膠原組織呈藍(lán)色，彈力纖維棕色，肌纖維、 纖維素、紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色。 試劑配制： 地衣紅酒精液 1g 70%酒精 100ml 濃鹽酸 1ml 結(jié)果： TanerUnna法，彈力纖維呈深棕紅色。 Verhoeff鐵蘇木素染色法：彈力纖維黑色或黑藍(lán)色，胞核黑色，膠原纖維呈紅色 Verhoeff鐵蘇木素染色法 Lendrum纖維素染色法 顯示腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)血栓形成 第四章： 免疫組織化學(xué)（ Immunohistochemistry） 一 ． 定義： 應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位、或定量研究，這種技術(shù)稱免疫組織化學(xué)（ immunohistochemistry） 或免疫細(xì)胞化學(xué)（ immunocytochemistry），簡(jiǎn)稱免疫組化。 1． 免疫組化的方法： 1） 直接法 2） 間接法： SPA、 PAP、 ABC、 LAB法等 ， 間接法 的靈敏度高于直接法 。 3． 根據(jù)標(biāo)記物區(qū)分：免疫熒光法 、 放射免疫法 、 酶標(biāo)法和 免疫金銀法 。 反差 二 ． 免疫組化的基本知識(shí) 1． 原理 ：抗體與抗原間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫紐織化學(xué)正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，通過(guò)免疫后獲得特異性抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。在組織處理過(guò)程中，如固定、包埋、薄切、反應(yīng)，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定液及包埋方法要十分注意。 1〕 抗體的制備方法： A 多克隆抗體 （血清抗體 〕 ：指機(jī)體接受抗原主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后從血清中分離提純的抗體。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。將該免疫細(xì)胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（ monoclonal antibody,McAb) 2) 單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類抗體的混合物 單一種類的抗體 特異性 低針對(duì)多個(gè)抗原決定族 高針對(duì)單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應(yīng) 高 低 4． 抗原與抗體的特異性結(jié)合 抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。超變區(qū)直接參與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個(gè)淺平穴槽，槽大小約 入槽內(nèi)，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而相互結(jié)合。 三 ． 免疫組織化學(xué)的基本技術(shù) （ 一 〕 取材 1． 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：麻醉 （ 處死 〕 ， 鋒利刀片切成大小適中 ， 厚度 3mm～ 4mm。 1． 常用的固定劑： 1） 甲醛緩沖液：廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定 ， 甲醛在很好地保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)也有效地保存某些抗原 。 2） 4％ 多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究 。 4） 其它：如 PLP液 （ 過(guò)碘酸 ~賴 AA~多聚甲醛固定液 ） 、 丙酮及醇類 、 鋨酸等 。 中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用最廣的固定劑 。 3） 固定時(shí)間：與組織塊大小成正比 ， 與固定液濃度成 反比 。 5〕 固定后處理：充分沖洗 ， 除去多余固定劑 。 （ 四 ） 切片： ： 1） 清洗 ； 2） 涂膠 （ 防止脫片 ） 常用粘附劑： ① 明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠； ② 樹(shù)脂膠： 也稱白膠； ③ 多聚賴氨酸 （ PLL） ； ④ 商品化粘附劑 。m 放置 37 ℃ 溫箱烘烤過(guò)夜 ， 以減少脫片 。m 。 切片較厚 ， 可將陽(yáng)性部位作電鏡包埋 。 四 ． 免疫組化染色過(guò)程中的基本技術(shù) （ 一 ） 蛋白酶消化技術(shù) 進(jìn)行固定時(shí) ， 抗原決定簇有可能被固定劑所封閉 ， 因此在抗原抗體反應(yīng)前 ， 常用蛋白酶處理組織切片 ， 使抗原決定簇充分暴露出來(lái) ， 并使組織的通透性增高 ， 以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)特異性染色 。 消化結(jié)束后要充分洗滌 ， 以除去殘留的蛋白酶 。 1． 原因分析： 組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光 、 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶或堿 性磷酸酶 、 內(nèi)源性生物素等； 試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過(guò)量等。 B . 減少非特異性染色： a 免疫酶組化染色時(shí) ， 在加 1抗前 ， 用 ％ 的 H2O2甲醇溶 液將組織切片處理 30分 （ 若是 3％ 的 H2O2甲醇溶液處 理 5~10分 ） 。 （ 二 ） 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照片：用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本作對(duì)照 。 （ 三 ） 抗體的分裝 、 稀釋 、 滴加及保存 1． 抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的 EP管內(nèi) ， 保存在 20 ～ 40 ℃ 的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效 。l ，最好在滴加前 ， 用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫(huà)一圈 ， 以防溶液的擴(kuò)散 。 （ 四 ） 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù) 1． 免疫酶染色原理： 用酶作為標(biāo)記物 ， 可分為直接法 、 間接法 、 補(bǔ)體法 、 免疫 酶橋法 、 免疫酶雙橋法 、 過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 （ PAP法 ） 和雙 PAP法等 。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)；缺點(diǎn)：敏感性差。 如： 1抗是由免產(chǎn)生的多克隆抗體： 則 2抗常用羊抗兔 IgG； 如： 1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體：