【正文】 器材： 1） 實驗臺：光線充足 ， 方便操作 。 常用的有 PAP、 sABC、 LsAB法 （ 附圖表說明 ） 。在這種過程中酶是通過免疫學原理與抗酶抗體結合，避免了酶標時化學反應對抗體和酶活性的破壞。 該方法適用于石蠟包埋的組織切片 。 以上兩種方法稱為酶標抗體法 3） 非酶標記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物 ， 產(chǎn)生抗酶的抗體 。 2） 間接法原理：先用標記的特異性 1抗與標本中相應抗原結 合 ， 再用酶標記的抗球蛋白抗體 （ 2抗 ） 孵育 ， 然后再加 酶的底物 ， 顯示抗原～抗體～抗原抗體復合物存在的部 位 ， 以對抗原進行檢測 。 1） 直接法原理：用酶直接標記在特異性 1抗上 ， 與標本中的 抗原結合 ， 讓酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物 ， 沉淀在抗原 抗體反應部位 ， 即可在鏡下對標本的抗原進行檢測 。 4． 保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存 ， 已稀釋未 用完的抗體最好在一周內用完 ， 不宜長期保存 。 2． 抗體稀釋：常用 PBS（ 磷酸緩沖溶液 ） 或 BSA （ 牛血清白蛋白 ） 3． 滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片 ， 一般加 30～ 50181。 陰性對照片：確認不含己知抗原的標本作對照 。 b 免疫熒光染色時 ， 可用 ~％ 伊文思藍稀釋熒光 抗 體 。 2． 消除方法： A. 加 1抗前加正常血清 10~30分 ， 以封閉組織中帶電荷的基 因 ， 避免與 1抗的非特異性結合 。 1） 非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反應所出現(xiàn)的染色 。 1． 常用的消化酶：胰蛋白酶 、 胃蛋白酶 2． 消化時間：因組織而異 ， 一般為 5~30分鐘 ， 消化時間不宜太長 ， 以免損傷組織形態(tài) ， 破壞抗原決定族 。 神經(jīng)組織應用 較多 。 3） 振動切片：特點是組織經(jīng)固定后不需包埋 ， 只要用膠水粘在 載物臺上即可切片 。 2） 冷凍切片： 2 181。 ： l） 石蠟切片：厚約 3～ 5 181。 （ 三 ） 包埋： ； ； 。 4） 溫度：一般在室溫下進行 ， 電鏡標本和固定時間較長時 可放置在 4℃ 冰箱 。 2） 組織塊的大?。? 。 2． 固定注意事項： 1） 固定液的選擇標準： A. 組織形態(tài)結構保存良好； B. 最大限度 保存抗 原的抗原性 。 3） 戊二醛 ~多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡 、 電鏡免疫組織化學研究 。 由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細胞膜的通透性不利于染色時抗體的滲透 ， 因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露 ，固定時間不直超過 24h。 小型實驗動物：灌注 （ 流 ） 固定 （ 生理鹽水和 4％ 多聚甲醛 〕 取材 2． 人體材料：活檢組織 、 手術標本 、 細胞和組織 （ 二 ） 固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下 ，應采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間 ， 固定時間一般為1~12h。抗原與抗體分子的結合不受兩者數(shù)量比例的限制，但如要出現(xiàn)肉眼可見的反應， 則抗原與抗體的量需有一定的適當?shù)谋壤?，否則在抗原與抗體過量的情況下，不能聚合成大顆粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見的反應。在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)中有 3個特殊的易變部位，即在第 30位、 50一 60位和第 100位氨基酸殘基附近，這些部位稱為超變區(qū)。這種融合的雜交細胞既有骨髓細胞的無限生長能力，又有漿細胞分泌單一抗體的能力。 B 單克隆抗體 ：是 1975年由 Kohlenh Milstein發(fā)明的一種新技術。 ：抗體是機體受抗原刺激后，由 B淋巴細胞、特別是漿細胞分泌產(chǎn)生的一種與相應抗原發(fā)生反應的一種球蛋白，即免疫球蛋白（ Immunoglobulin,Ig)，共有五類： IgG, IgA, IgM, IgD, 和 IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以 IgG為主，約占 70~80％。 ：上述談到的抗原或半抗原物質，防止在組織或細胞內丟失是非常重要的。由于抗原與抗體結合后形成的免疫復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來，以期達到對組化或細胞中的未知抗原進行定性、定位甚至定量的研究。 其中免疫熒光法和酶標法應用 廣泛 。 2． 標記的物質：熒光染料 、 放射性同位素 ， 酶 （ 辣根過氧 化物酶 、 堿性磷酸酶等 ） 鐵蛋白 、 膠體金等 。免疫組化技術是 1941年 Coons等學者首創(chuàng)的，隨著其理論及技術的發(fā)展，目前已發(fā)生了日新月異的變化。 Verhoeff鐵蘇木素染色法，彈力纖維呈黑色。 7. 彈力纖維染色法 病理診斷應用彈力纖維染色，目的是觀察組織內彈力纖維是否增生或破壞、斷裂和崩解，從而幫助診斷。 結果： 細胞核呈紅色，基底膜、膠原纖維呈藍綠色，免疫復合物呈紅色。亮綠 ， %醋酸 100ml。 Mallory 6. Masson三色染色法 1〕 試劑配制 （ 1〕 Masson復合染色液。 結果： 膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍色，軟骨、粘液、淀粉樣變性物質呈淡藍色，神經(jīng)膠質纖維、肌纖維和酸性顆粒呈紅色，髓鞘和紅細胞呈橘紅色。酸性復紅 ，蒸餾水 100ml。重鉻酸鉀 ，醋酸 5ml，蒸餾水 95ml； （ 2〕 苯胺藍橘黃 G液。 結果： 淀粉樣物質呈紅色，細胞核呈藍色。剛果紅 1g，蒸餾水 100ml； （ 2〕 Harris蘇木素染色液。組織出現(xiàn)此物質稱為淀粉樣變性。 結果： 真菌均呈黑色，菌絲和孢子呈黑褐色，細胞核呈紅色，背景呈淡綠色。亮綠 ，蒸餾水 100ml，冰醋酸 。六胺銀原液 25ml，蒸餾水 25ml， 5％硼砂水溶液 2ml； （ 3〕 核固紅染液。 1〕 試劑的配制： （ 1〕 六次甲基四胺、硝酸銀原液（簡稱六胺銀原液 〕 。 PASM染色 PASM染色 PASM PASM 附： PASM對真菌的染色 真菌（ fungus〕 ，又稱霉菌，其種類較多。 注： 2％硝酸銀配制胺溶液，染色時間 40分鐘，溫度 55~60℃ ，隨時鏡下觀察便于控制。 阿爾辛藍－阿爾辛黃法：常用于黏液上皮腫瘤的鑒別診斷 阿爾辛藍過碘酸雪夫反應：是顯示中性和酸性黏液物質的有效方法 HID/AB:高鐵二胺奧新藍法 AB/PAS 3. 六胺銀（ PASM〕 染色 在腎臟活體組織檢查和一些真菌感染的組織選用此方法。 3〕 結果： 細胞核呈藍色，基底膜呈紅色，膠原纖維、肌纖維及細胞漿呈紅色。 （ 6〕 置入遮光瓶內并放入在 4℃ 冰箱內保存?zhèn)溆谩? 1〕 schiff氏試劑的配方： （ 1〕 將 200ml蒸餾水煮沸； （ 2〕 冷卻至 90℃ 時，慢慢加入堿性復紅 1g。 2〕 染色方法： （ 1〕 標本常規(guī)甲醛固定后流水沖洗 12h； （ 2〕 用濾紙吸干標本表面的水分，把標本放入蘇丹 III染液中浸泡 30min； （ 3〕 用 70％乙醇分化，以脂肪組織呈橙黃色，其它組織不著色為佳； （ 4〕 水洗后浸存在 5％甲醛液中，為了防腐可加入適量的防腐劑。 目前市場上有配制好的特殊染色試劑 介紹常用的幾種特殊染色 1. 脂肪染色 主要用于心、肝、腎的脂肪變性，動脈粥樣硬化，以及因脂肪栓塞導致的死亡病例鑒定等。 HE切片 第三章 特殊染色 HE染色雖是一種快速、經(jīng)濟、且易掌握的方法，但它不能回答病因學、 Z組織發(fā)生及發(fā)病機制等方面的許多問題。可采用低溶點石蠟（ 48~50 ℃ 〕 。 3〕 浸透和包埋：可使組織具有一定的硬度和韌度，便于切成薄的切片。 2〕 透明：目的是使能與石蠟結合溶解的媒介劑進入組織，進而將不能與石蠟結合的脫水劑置換出來，并使組織透明。以便使切片時的支撐物（石蠟 〕 充分進入組織內。 4. 大體標本的脫水、包埋和切片 為能制成滿意的切片，固定后的組織還要經(jīng)過脫水、透明、浸蠟及包埋等一系列程序。 3〕 固定液的特性 甲醛固定液滲透力強，固定均勻，對組織收縮較小，并能增加組織韌性的優(yōu)點，而且可以保存組織內的脂類物質，對組織的主要作用為硬化和防腐。 2〕 固定液的選擇： （ Fomaldehyde〕 ，又稱福爾馬林，其濃度在4％，它是一種還原劑，極易揮發(fā)，散發(fā)出強烈的刺激性氣體，使人流鼻涕、流眼淚，呼吸道有異物感。 肺組織的取材要清楚的了解各葉肺組